1、胃癌是世界范圍內(nèi)的高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率居各種惡性腫瘤第二位，僅次于肺癌;其致死率占癌癥相關(guān)死亡率的第二位。中國是胃癌高發(fā)病率的國家，世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示中國每年新發(fā)胃癌患者占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42％。由于缺乏有效的早期診斷分子標(biāo)志而導(dǎo)致胃癌的早期診斷困難，多數(shù)患者初診時(shí)已是胃癌晚期失去手術(shù)機(jī)會(huì);另外胃癌對現(xiàn)有的放化療不夠敏感，因而胃癌的預(yù)后不佳，文獻(xiàn)報(bào)道胃癌患者的五年生存率只有24％。因此，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制是尋找有效的診

2、斷標(biāo)志和改進(jìn)治療方案的根本。
　　 惡性腫瘤的標(biāo)志是無限的細(xì)胞增殖。影響細(xì)胞增殖的因素包括兩類，即促進(jìn)增殖的正調(diào)控因素和抑制增殖的負(fù)調(diào)控因素，它們共同作用于細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等相關(guān)基因。正常情況下，二者力量的平衡使細(xì)胞處于可控的正常生長狀態(tài);二者力量的失衡將導(dǎo)致上述基因表達(dá)的失調(diào)使細(xì)胞生長失控而誘發(fā)癌癥。鳥氨酸脫羧酶(ODC)是催化多胺生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān);RUNX3是重要的

3、調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞生長的轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制細(xì)胞周期進(jìn)行、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。為進(jìn)一步解析胃癌的發(fā)病機(jī)制，本文深入研究了ODC和RUNX3在胃癌發(fā)生中表達(dá)失調(diào)的分子機(jī)制，以期為胃癌的防治提供理論支持和指導(dǎo)。
　　 第一部分
　　 H.pylori毒力因子CagA激活Src/MEK/ERK/c-Myc信號通路上調(diào)鳥氨酸脫羧酶(ODC)表達(dá)參與胃癌發(fā)生
　　 幽門螺桿菌(Helicobacterpylor

4、i，H.pylori)的感染可以誘發(fā)胃癌已經(jīng)得到公認(rèn)，其感染首先誘發(fā)胃炎，慢性炎癥的長期刺激使細(xì)胞過度增殖而促進(jìn)胃癌發(fā)生。H.pylori的毒力因子眾多，與胃癌發(fā)生關(guān)系最密切的是細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（cytotoxin-associatedgeneA，cagA）。研究報(bào)道慢性胃炎和胃癌患者中ODC酶活性升高，H.pylori感染陽性的慢性胃炎患者較陰性患者ODC酶活性升高，但分子機(jī)制不明;成纖維細(xì)胞中c-Myc可以轉(zhuǎn)錄激活ODC表達(dá)，胃上

5、皮細(xì)胞中尚不清楚二者的關(guān)系。為此，本課題深入探討了胃上皮細(xì)胞中ODC的表達(dá)是否受H.pylori及其毒力因子CagA調(diào)節(jié)，c-Myc是否發(fā)揮作用，以及ODC對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 目的:
　　 探討ODC在H.pylori感染后表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制及其在胃癌發(fā)生中的作用。
　　 方法:
　　 (1)免疫組化檢測慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎和原發(fā)性胃癌患者臨床標(biāo)本中的ODC和c-Myc蛋白表達(dá)，將

6、免疫組化結(jié)果量化后用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 (2)用不同的H.pylori菌株（cagA野生株和突變株）以100∶1（細(xì)菌與細(xì)胞數(shù)之比）感染胃癌細(xì)胞AGS及胃上皮永生化細(xì)胞GES-1，Westernblot檢測ODC蛋白表達(dá)的變化。將野生型CagA真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-WT-cagA）轉(zhuǎn)染AGS、GES-1和胃癌細(xì)胞BGC-823，24h后收集細(xì)胞，分別用QRT-PCR和Westernblot檢測ODCmR

7、NA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測c-myc基因表達(dá)變化。
　　 (3)構(gòu)建野生型ODC基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（包含2個(gè)c-Myc結(jié)合元件），雙酶切和DNA測序鑒定正確后以其為模板構(gòu)建c-Myc結(jié)合元件缺失的ODC基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并用雙酶切和DNA測序鑒定。將野生型和突變型ODC基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別與pcDNA-3.1-WT-cagA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測熒光素酶報(bào)告基因的活性變化。
　　 (

8、4)構(gòu)建c-mycsiRNA表達(dá)質(zhì)粒（pSUPER-c-myc），DNA測序正確后將其轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞抑制c-Myc蛋白表達(dá)，再轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-WT-cagA，Westernblot檢測ODC蛋白表達(dá)的變化。
　　 (5)用特異性信號蛋白抑制劑預(yù)處理細(xì)胞（PP1阻斷Src家族激酶活性，PD98059抑制MEK1激酶活性，LY294002阻斷PI3K激酶活性，BAY11-7082抑制NF-κB活性），再轉(zhuǎn)染pcDNA3

9、.1-WT-cagA;另外將突變型CagA表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-PR-cagA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24h后收集細(xì)胞用Westernblot檢測ODC蛋白表達(dá)的變化。
　　 (6)先用表達(dá)GFP的ODCantisenseRNA腺病毒感染BGC-823細(xì)胞48h，再用H.pylori感染細(xì)胞2h，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)免疫組化檢測結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎和胃癌患

10、者中ODC蛋白表達(dá)水平和陽性率依次增高，伴有腸化生的慢性胃炎患者均有ODC表達(dá)。
　　 (2)H.pylori26695感染GES-1細(xì)胞0、1、2、4、8h后ODC蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性上調(diào)，NCTC11637菌株感染GES-1細(xì)胞4h后也誘導(dǎo)ODC蛋白表達(dá)上調(diào)，用兩種菌株分別感染AGS細(xì)胞同樣誘導(dǎo)ODC蛋白表達(dá)上調(diào)。而cagA基因敲除的H.pylori26695感染細(xì)胞則不能誘導(dǎo)兩種細(xì)胞中的ODC蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　

11、(3)將pcDNA3.1-WT-cagA分別轉(zhuǎn)染AGS、BGC-823和GES-1后，ODCmRNA和蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯上調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，CagA能夠增強(qiáng)野生型ODC基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的熒光素酶活性。
　　 (4)c-mycmRNA和蛋白表達(dá)在CagA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中出現(xiàn)同步上調(diào)，將慢性胃炎和胃癌標(biāo)本中c-Myc和ODC的免疫組化結(jié)果量化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯示二者表達(dá)密切相關(guān)(ρ=0.635，p＜0.001)。雙熒光

12、素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示CagA不能增強(qiáng)c-Myc結(jié)合元件缺失的ODC基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染pSUPER-c-myc抑制胃癌細(xì)胞中c-Myc蛋白表達(dá)后可以取消CagA誘導(dǎo)的ODC蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 (5)特異性信號蛋白抑制劑處理細(xì)胞后用Westernblot檢測ODC蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PP1、PD98059、LY294002和BAY11-7082均可以抑制CagA誘導(dǎo)的ODC蛋白表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PR-c

13、agA（表達(dá)的CagA蛋白不能被細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶磷酸化）則不能誘導(dǎo)ODC蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　 (6)用ODCantisenseRNA抑制細(xì)胞內(nèi)ODC蛋白表達(dá)后，能夠明顯削弱胃癌細(xì)胞在感染H.pylori前后的克隆形成能力。
　　 結(jié)論:
　　 (1)ODC蛋白參與胃癌發(fā)生過程，腸化生與ODC蛋白表達(dá)密切相關(guān)。
　　 (2)野生型和突變型ODC基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和c-mycsiRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

14、成功。
　　 (3)H.pylori誘導(dǎo)ODC蛋白表達(dá)上調(diào)依賴其毒力因子CagA的表達(dá)，CagA通過增強(qiáng)ODC基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)ODC基因表達(dá)。
　　 (4)c-Myc結(jié)合序列對于CagA增強(qiáng)ODC啟動(dòng)子活性是必需的，細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白是CagA誘導(dǎo)ODC蛋白上調(diào)必需的。
　　 (5)Src，MEK，PI3K和NF-κB信號途徑參與CagA誘導(dǎo)的ODC蛋白表達(dá)上調(diào)，CagA以磷酸化形式發(fā)揮誘導(dǎo)作用。

15、>　　 (6)降低ODC蛋白水平削弱胃癌細(xì)胞在感染H.pylori前后的克隆形成能力。
　　 第二部分
　　 miR-532-5p負(fù)性調(diào)節(jié)RUNX3表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖
　　 RUNX3以轉(zhuǎn)錄因子的方式調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)最終抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移而發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。研究表明，由于基因啟動(dòng)子過度甲基化、等位基因的雜合性缺失和RUNX3蛋白在細(xì)胞漿的滯留使得RUNX3在許多人類原發(fā)性胃癌中失

16、活。盡管如此，部分胃癌患者出現(xiàn)RUNX3表達(dá)下調(diào)，卻缺乏上述失活機(jī)制的存在，表明有其他因素調(diào)控RUNX3的表達(dá)。近年來，miRNA的發(fā)現(xiàn)及其研究領(lǐng)域的興起開啟了RUNX3表達(dá)下調(diào)機(jī)制研究的新篇章。本課題從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平(miRNA)出發(fā)，探討了miRNA-532-5p調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞中RUNX3表達(dá)的分子機(jī)制，以及miR-532-5p對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　 目的:
　　 探討胃癌中miR-532-5p調(diào)節(jié)RUN

17、X3表達(dá)的分子機(jī)制，以及miR-532-5p對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　 方法:
　　 (1)QRT-PCR和Westernblot檢測7種胃癌細(xì)胞和胃上皮永生化細(xì)胞GES-1的miR-532-5p、RUNX3mRNA和蛋白表達(dá)。蛋白檢測結(jié)果量化后，用SPSS軟件對miR-532-5p與RUNX3mRNA、蛋白表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　 (2)構(gòu)建miR-532-5p真核表達(dá)質(zhì)粒（pSilencerTM4

18、.1-CMV-532），雙酶切和DNA測序鑒定正確后將其轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞和胃上皮永生化細(xì)胞。同時(shí)將miR-532-5p特異的mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，QRT-PCR和Westernblot檢測miR-532-5p、RUNX3蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測RUNX3靶分子p21和Bim蛋白的表達(dá)。
　　 (3)構(gòu)建包含miR-532-5p結(jié)合序列的RUNX33'UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pMIR-REPORTTM-RUN

19、X3WTUTR，野生型），雙酶切和DNA測序鑒定正確后以其為模板構(gòu)建miR-532-5p結(jié)合序列突變的RUNX33'UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pMIR-REPORTTM-RUNX3MutUTR，突變型），雙酶切和DNA測序驗(yàn)證突變序列。
　　 (4)將miR-532-5p特異的mimics分別與野生型和突變型RUNX33'UTR的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pMIR-REPORTTM-β-galControl質(zhì)粒校

20、正因轉(zhuǎn)染效率所致差異。48h后收集細(xì)胞檢測熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性及β-galactosidase活性。
　　 (5)將miR-532-5p特異的mimics轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，AnnexinV/PI雙熒光染色檢測細(xì)胞凋亡，PI染色檢測細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果:
　　 (1)胃癌細(xì)胞和胃上皮永生化細(xì)胞中miR-532-5p、RUNX3mRNA及蛋白的檢測結(jié)果顯示，miR-532-5p在AGS、KATO-Ⅲ和N

21、UGC-3中表達(dá)水平最高，但這三種細(xì)胞中RUNX3表達(dá)缺失;BGC-823、GES-1、SGC-7901和MKN-45中RUNX3表達(dá)水平較高，而miR-532-5p表達(dá)水平較低。將蛋白檢測結(jié)果量化后用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示，miR-532-5p與RUNX3mRNA及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.738和-0.776，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 (2)雙酶切和DNA測序驗(yàn)證pSilencer

22、TM4.1-CMV-532均正確，QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，4種轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的miR-532-5p表達(dá)明顯上調(diào)，質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 (3)將miR-532-5pmimics轉(zhuǎn)染BGC-823、GES-1和SGC-7901細(xì)胞，miR-532-5p表達(dá)水平明顯上升，而RUNX3蛋白表達(dá)則明顯下降。轉(zhuǎn)染pSilencerTM4.1-CMV-532也可以抑制RUNX3蛋白的表達(dá)，但抑制效果不如轉(zhuǎn)染mimics明顯。相反，轉(zhuǎn)染inhi

23、bitor后細(xì)胞內(nèi)miR-532-5p表達(dá)水平下降，RUNX3蛋白表達(dá)則升高。
　　 (4)單熒光素酶報(bào)告基因活性分析結(jié)果顯示，miR-532-5p的表達(dá)可以明顯降低野生型RUNX33'UTR介導(dǎo)的熒光素酶活性，而對突變型RUNX33'UTR介導(dǎo)的熒光素酶活性沒有影響。
　　 (5)Westernblot檢測結(jié)果顯示，miR-532-5pmimics可以明顯下調(diào)RUNX3靶分子p21和Bim蛋白的表達(dá)，而miR-532-

24、5pinhibitor則可以上調(diào)p21和Bim蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，miR-532-5pmimics減少胃癌細(xì)胞的凋亡比例，減少G1期、增加G2-M期細(xì)胞的比例。
　　 結(jié)論:
　　 (1)在胃癌及胃上皮永生化細(xì)胞中miR-532-5p可以負(fù)性調(diào)節(jié)RUNX3蛋白表達(dá)。
　　 (2)三個(gè)質(zhì)粒pSilencerTM4.1-CMV-532，pMIR-REPORTTM-RUNX3WTUTR和pMIR-REPO