1、在玉米不同自交系基因組間存在著豐富的SNPs(singlenucleotidepolymorphisms)和InDels(insertion/deletionpolymorphisms)，這為開(kāi)發(fā)SNP分子標(biāo)記、鑒別不同等位基因型提供了便利。目前已有多種檢測(cè)SNP的方法，其中等位基因特異PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種基于PCR技術(shù)的快速、簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉的檢測(cè)等位基因型的技術(shù)，但是因其特異引

2、物3’端的第一個(gè)堿基有可能與模板錯(cuò)配從而影響了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。為了準(zhǔn)確地檢測(cè)玉米的等位基因型，可以根據(jù)玉米基因組豐富的SNPs和InDels設(shè)計(jì)同時(shí)包含多個(gè)SNP和InDel位點(diǎn)的等位基因特異PCR引物，這種引物可以克服單個(gè)SNP或InDel位點(diǎn)可能存在著錯(cuò)配的缺點(diǎn)來(lái)準(zhǔn)確地檢測(cè)玉米等位基因型，并進(jìn)一步檢測(cè)等位基因在雜交種中的表達(dá)情況。 為了驗(yàn)證利用該方法是否可以方便、準(zhǔn)確地檢測(cè)玉米等位基因型，并檢測(cè)等位基因在雜交種中的表達(dá)情況

3、。本課題以一個(gè)淹水脅迫后在自交系Mo17和Hz32之間存在著表達(dá)差異的基因ZmZF為例來(lái)開(kāi)展研究，旨在建立一種快捷準(zhǔn)確的鑒別等位基因型以及檢測(cè)等位基因在雜交種中表達(dá)的方法。研究結(jié)果如下： (1)根據(jù)已經(jīng)公布的ZmZF基因cDNA序列設(shè)計(jì)的引物在兩個(gè)親本材料受水淹處理后的cDNA中擴(kuò)增出了大部分ZmZF基因cDNA中的3’UTR和一小部分的編碼區(qū)序列，在這兩個(gè)部分序列間共包含了3個(gè)SNP位點(diǎn)和3個(gè)InDel位點(diǎn)。 (2)根

4、據(jù)等位基因特異PCR方法的原理，把SNP和InDel位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)在正反分型引物中，然后用這些引物進(jìn)行PCR，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物來(lái)鑒別ZmZF-Mo17和ZmZF-Hz32基因型的cDNA模板。通過(guò)比較，初步篩選到了包含SNP位點(diǎn)的正向引物Pa、Pg和包含InDel位點(diǎn)的反向引物Ph、Pm能夠準(zhǔn)確地區(qū)分出這兩種等位基因型。進(jìn)一步地對(duì)這兩對(duì)分型引物在不同Mg2+和dNTP濃度下的穩(wěn)定性作了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這兩對(duì)分型引物在一定濃度范圍

5、內(nèi)都能穩(wěn)定地區(qū)分這兩種等位基因型。另外用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)也能夠準(zhǔn)確地鑒別出這兩種等位基因型。這些結(jié)果說(shuō)明結(jié)合了SNP和InDel位點(diǎn)的分型引物比只包含一個(gè)SNP位點(diǎn)的分型引物檢測(cè)的準(zhǔn)確性強(qiáng)，利用該引物可以快捷準(zhǔn)確地進(jìn)行玉米基因分型和等位基因在雜交種中的表達(dá)檢測(cè)。 (3)用分型引物做半定量RT-PCR檢測(cè)ZmZF等位基因在雜交種以及兩個(gè)親本根系中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：在雜交種中與在親本中一樣，與0h的對(duì)照相比，在淹水脅迫后，ZmZ

6、F-Mo17表達(dá)量明顯升高，而ZmZF-Hz32表達(dá)量比較穩(wěn)定，并且比ZmZF-Mo17低。水淹8h后的不同材料的葉片用半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)等位基因在葉片中的表達(dá)和根系中一樣也存在著差異。用分型引物做實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：兩個(gè)等位基因在雜交種中的表達(dá)與在兩親本中一樣存在著差異，但淹水脅迫24h后，在雜交種中ZmZF-Mo17的表達(dá)量較16h少。這些結(jié)果表明：在淹水脅迫下，玉米雜交種中也存在著等位基因表達(dá)的差異，這種差