1、目的: 探討慢性丙型肝炎患者血清Th1/Th2細(xì)胞因子水平變化及其與干擾素療效的關(guān)系。 材料和方法: 一、材料 1、研究對(duì)象 應(yīng)用干擾素聯(lián)合利巴韋林治療的慢性丙型肝炎患者30例，男15例，女15例，年齡34—66歲，平均年齡48.5±8.11歲。治療療程為48周。療效判定：應(yīng)答組：治療結(jié)束時(shí)ALT正常，HCVRNA陰轉(zhuǎn)，并持續(xù)半年以上；無(wú)應(yīng)答組，治療結(jié)束時(shí)ALT未恢復(fù)正常或HCVRNA持續(xù)陽(yáng)性。正

2、常對(duì)照組15例：標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院體檢中心。 2、試劑與儀器 HCVRNA提取試劑：TRIZOL、氯仿、異丙醇、75％乙醇、DEPC水等；測(cè)序產(chǎn)物純化試劑：EDTA(PH8.0)，NaAc(PH5.2)，無(wú)水乙醇，70％乙醇，HiDiFormamide(甲酰胺)等；RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒及PCR反應(yīng)引物購(gòu)自TaKaRa(大連)有限公司；細(xì)胞因子IL—2、IFN—γ、IL—6、IL-

3、10、IL-12p40及IL-12p70檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京晶美生物工程有限公司，IL—5購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)PE公司產(chǎn)品，型號(hào)PE2400；電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；凝膠成像系統(tǒng)，SHIDZU公司；紫外分光光度計(jì)，型號(hào)UV—160A，USA；ABI3130全自動(dòng)測(cè)序儀：AB I美國(guó)；XW—80A旋渦振蕩器：上海青浦瀘西儀器廠(chǎng)K10CD；干式恒溫器：杭州藍(lán)焰科技有限公司；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：LD25—2A，北京醫(yī)

4、用離心機(jī)廠(chǎng)；臺(tái)式高速離心機(jī)：上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng)生產(chǎn)，型號(hào)TGL-16G；伯樂(lè)全自動(dòng)酶標(biāo)儀680，美國(guó)BIO—RAD公司；超低溫冰箱，MDF—1155—1520C，日本三洋公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱，WJ—22C Maf． NO． W—1343，日本產(chǎn)。 二、方法 1、血清細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清IL—2、IL-10、IFN—γ、IL—5、IL—6、IL-12p40及IL-12p70，按試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行檢

5、測(cè)。 2、HCV基因分型檢測(cè) 采用直接測(cè)序法，根據(jù)5'UTR核苷酸序列進(jìn)行分型。血清中提取HCV RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷大小約為450bp。PCR產(chǎn)物純化后由沈陽(yáng)市傳染病院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站核對(duì)序列，確定HCV基因型。 3、HCVRNA載量檢測(cè) 采用特異性熒光探針PCR法，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。 4、血清ALT

6、檢測(cè) 由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)的8200A全自動(dòng)生化分析儀常規(guī)檢測(cè)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，所用方法包括：均數(shù)的比較、X2檢驗(yàn)和Biraviate相關(guān)性檢驗(yàn)。P值<0.05為顯著性差異水平。 結(jié)果: 1、干擾素治療結(jié)果 30例患者中，應(yīng)答組14例，無(wú)應(yīng)答組16例，干擾素治療持續(xù)應(yīng)答率46.7％。應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組相比，年齡、

7、性別、體重及血清HCVRNA載量均無(wú)顯著差異，血清ALT水平明顯高于無(wú)應(yīng)答組。應(yīng)用Peg干擾素者應(yīng)答率為62.5％，普通干擾素為40.9％，兩者無(wú)顯著性差異。 2、HCV基因型分布及不同基因型患者干擾素治療的應(yīng)答率 基因型分布以1b型最多，占46.7％，其余依次為2a型20％、1a型13.3％、2b型10％、3a型6.7％和1c型3.3％。1b型應(yīng)答率為35.7％，2a型為66.7％，但統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著性差異。

8、3、慢性丙型肝炎患者血清細(xì)胞因子水平的變化 慢性丙型肝炎組血清IL—2水平明顯低于健康對(duì)照組，IL—5和IL-12p40水平明顯高于后者，其它細(xì)胞因子水平兩組之間無(wú)顯著差異。 4、血清細(xì)胞因子水平與HCV基因型的關(guān)系 HCV基因型1型患者血清IL—6含量明顯高于2型患者，其它細(xì)胞因子水平無(wú)差異；而1型和3型以及2型和3型之間所有細(xì)胞因子水平均無(wú)顯著性差異。各亞型之間比較發(fā)現(xiàn)：2a型患者血清IL—2含量明顯低于2

9、b型。 5、血清細(xì)胞因子水平與ALT和HCVRNA載量的關(guān)系 血清IL—6含量與血清ALT水平呈正相關(guān)，與RNA載量呈負(fù)相關(guān)，其余細(xì)胞因子水平與ALT和HCVRNA載量無(wú)顯著性相關(guān)。 6、血清細(xì)胞因子水平與干擾素療效的關(guān)系 干擾素治療應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組治療前血清細(xì)胞因子水平均無(wú)顯著性差異，應(yīng)答組治療結(jié)束時(shí)IFN—γ水平較治療前明顯升高，其它細(xì)胞因子水平無(wú)顯著性差異。無(wú)應(yīng)答組治療前后所有血清細(xì)胞因子水平均無(wú)顯

10、著性差異。 結(jié)論: 1、慢性丙型肝炎患者存在Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，血清Th1細(xì)胞因子水平下降，Th2細(xì)胞因子水平升高可能與丙型肝炎慢性化有關(guān)。 2、IL—6可能與肝臟炎癥活動(dòng)相關(guān)。 3、HCV基因型1型患者血清IL—6水平高于2型，2a型IL—2水平低于2b型，檢測(cè)的其它細(xì)胞因子水平與基因型無(wú)關(guān)。 4、干擾素治療前血清細(xì)胞因子水平與干擾素治療效果無(wú)關(guān)，不能對(duì)療效進(jìn)行預(yù)測(cè)，干擾素誘導(dǎo)的Th1細(xì)