1、為了防止北京近郊甜椒上新出現(xiàn)病害-辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)病害的蔓延和危害，本研究開發(fā)了一種地高辛標(biāo)記的cDNA探針利用核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)對PMMoV進(jìn)行檢測研究。通過對探針特異性和靈敏度的測試，證明了該探針能夠特異檢測PMMoV，稀釋限點(diǎn)對應(yīng)的植物組織材料為0.8μg，與RT-PCR及DAS-ELISA兩種方法比較，比DAS-ELISA方法靈敏(39.06μg)，沒有RT-PCR靈敏(0.008μg)。但是綜合考慮地高辛標(biāo)記的cDN

2、A探針是大量田間樣品常規(guī)檢測較好的方法。采取北京郊區(qū)和河北保定地區(qū)的類似PMMoV癥狀的93種田間樣品和18種商品種子樣品進(jìn)行了檢測，將檢測結(jié)果用更加靈敏的RT-PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證，兩種方法結(jié)果基本一致，表明了地高辛標(biāo)記的cDNA探針在實(shí)際應(yīng)用中檢測結(jié)果可靠。通過對田間樣品的檢測，初步揭示了2006年北京附近地區(qū)PMMoV病害發(fā)生情況，對病害的防治有重要的指導(dǎo)意義。地高辛標(biāo)記探針的開發(fā)為今后PMMoV田間樣品的常規(guī)檢測提供了方便，快捷

3、，靈敏，安全的檢測方法，為PMMoV病害的防治奠定了基礎(chǔ)。 利用分步構(gòu)建策略構(gòu)建了含有PMMoV-CN全長基因組序列的侵染性cDNA克隆pMQC。構(gòu)建過程中在PMMoV-CN基因組序列的5'端引入了T7啟動子和提高轉(zhuǎn)錄效率的兩個(gè)G，3'端引入單一酶切位點(diǎn)SmaI，采用pMD18-Tsimple載體作為基礎(chǔ)載體，將PMMoV-CN全基因組序列分為三段逐步構(gòu)建到pMD18-Tsimple載體上，得到含有病毒全長基因組序列的重組載體之

4、后，利用SmaI酶切位點(diǎn)將載體線性化，以線性化載體為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種矮牽牛，莧色藜和昆諾藜，通過癥狀觀察以及分子生物學(xué)方法(包括RT-PCR，Westernblot和地高辛標(biāo)記的cDNA探針)驗(yàn)證了pMQC的侵染性。成功構(gòu)建PMMoV-CN的侵染性cDNA克隆，為今后PMMoV基因組功能及致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。 將侵染性克隆pMQC的CP置換為TMV-U1和ToMV-S1的CP得到了兩個(gè)雜合侵染性克隆pM

5、-T-CP和pM-To-CP，將兩個(gè)雜合侵染性克隆體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種矮牽牛和莧色藜觀察癥狀，以TMv-U1(ToMV-S1)和PMMoV-CN為參照，結(jié)果采用分子生物學(xué)方法(RT-PCR，核酸斑點(diǎn)雜交和Westernblot)進(jìn)行驗(yàn)證。 最終結(jié)果為：在矮牽牛上，pM-To-CP沒有侵染性；PMMoV-CNCP置換為TMVCP之后使PMMoV-CN由局部侵染變?yōu)橄到y(tǒng)侵染，說明TMVCP可能在pM-T-CP系統(tǒng)侵染矮牽牛中起主要作用，

6、CP可能作為主要因子協(xié)助該病毒在矮牽牛中進(jìn)行長距離運(yùn)動，TMV-U1和PMMoV-CNCP之間的差異是導(dǎo)致兩種病毒在矮牽牛上癥狀差異的決定因子。 在莧色藜上，pM-To-CP依然沒有侵染性；PMMoV-CNCP置換為TMVCP并沒有改變PMMoV-CN在莧色藜上的斑駁癥狀，說明PMMoV-CNCP可能在PMMoV-CN侵染莧色藜產(chǎn)生斑駁癥狀過程中沒有起到重要作用，或者PMMoV-CNCP在莧色藜上產(chǎn)生斑駁癥狀的作用被TMV-U1

7、CP彌補(bǔ)了，而且說明了TMV-U1在莧色藜上產(chǎn)生局部枯斑癥狀所需要的TMV中的無毒基因可能不是它的CP。TMV-U1CP與PMMoV-CNCP之間的差異不是兩種病毒在莧色藜上癥狀差異的決定因子。 為了進(jìn)一步確定PMMoV-CNCP序列中的哪一部分序列與TVMV-U1序列的差異導(dǎo)致它們在矮牽牛上癥狀為局部侵染和系統(tǒng)侵染的差異，本研究構(gòu)建了兩個(gè)雜合侵染性克隆，pM-T-CP1、pM-T-CP2，它們分別對應(yīng)著PMMoV-CNCP的1

8、-117、1-237位核苷酸序列置換為TMV-U1CP對應(yīng)序列。體外轉(zhuǎn)錄之后接種矮牽牛植株，觀察癥狀及通過分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證明了兩種雜合病毒對矮牽牛為局部侵染。 說明PMMoV-CNCP的1-117和1-237位的核苷酸與TMV-U1對應(yīng)序列的差異并沒有導(dǎo)致兩種病毒在矮牽牛上的癥狀差異。為了進(jìn)一步確定TMV-U1Cp序列中哪一部分序列在癥狀改變中起主要作用，今后的研究將對PMMoVCP其它部分的序列進(jìn)行置換以及采用定點(diǎn)突變等