1、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)首次于1967年從患呼吸道疾病的犬中分離獲得，是犬窩咳的主要病因之一。臨床表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕等呼吸道癥狀。當與細菌、病毒等混合感染時，可引起犬的死亡。血清學調(diào)查表明CPIV在世界各國普遍流行?，F(xiàn)有的關于CPIV流行病學調(diào)查資料顯示，在犬以及其他野生動物的血清樣品中，CPIV的陽性率較高。由于CPIV長期困擾著養(yǎng)犬業(yè)的健康發(fā)展，所以需要一種準確、簡便的診斷方法來

2、對該病作出準確診斷。
　　CPIV的NP蛋白是核衣殼蛋白的主要成分，與病毒RNA直接結(jié)合，高度保守，在病毒感染時可引起強烈的抗體反應。通過RT-PCR擴增NP基因，并將NP基因克隆到pET-30a載體，然后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞，構建重組質(zhì)粒pET-30a-NP，并對重組質(zhì)粒進行雙酶切和測序鑒定。利用IPTG對重組菌株進行誘導表達，獲得重組蛋白NP。對重組蛋白NP進行純化鑒定，SDS-PAGE的試驗結(jié)果顯示，重組蛋

3、白NP的分子量與預期大小相符;Westernblot的試驗結(jié)果顯示，重組蛋白NP能與CPIV陽性血清發(fā)生反應。
　　使用純化的重組NP蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，將SP2/0細胞與經(jīng)過免疫鼠的脾細胞進行細胞融合。用CPIV作為包被抗原，建立間接ELISA方法篩選雜交瘤細胞，經(jīng)過篩選得到3株陽性雜交瘤細胞株，能穩(wěn)定分泌單克隆抗體，命名為2F1、3B9、4D11。Western blot試驗和間接免疫熒光試驗(IFA)結(jié)果顯示，

4、3株陽性雜交瘤細胞上清均可以同CPIV發(fā)生特異性反應。將4D11雜交細胞株腹腔注射小鼠，獲取腹水，測得腹水效價為1∶104。
　　本研究以CPIV作為檢測抗原，以4D11單克隆抗體作為競爭抗體，建立競爭ELISA檢測方法并且對試驗條件進行優(yōu)化，確定試驗的最佳反應條件。利用已建立的競爭ELISA檢測方法檢測77份CPIV犬陽性血清，根據(jù)統(tǒng)計學方法計算得到陽性臨界值為15.1％。該方法與犬細小病毒(CPV)血清、犬瘟熱病毒(CDV)血