1、牙本質形成和礦化是牙齒發(fā)育和牙齒損傷修復過程中的重要組成部分。近年來，牙本質非膠原蛋白(Non-collagenousproteins，NCPs)在成牙本質細胞誘導分化和牙本質形成中作用的研究已成為牙齒發(fā)育生物學和牙髓生物學研究的熱點。到目前為止，大多數(shù)的研究集中于牙本質特異性蛋白，而關于礦化組織特異性蛋白在牙胚發(fā)育中作用的研究較少。牙本質基質蛋白1(Dentinmatrixprotein1，DMP1)是一種重要的礦化組織特異性蛋白，在

2、成牙本質細胞誘導、分化和牙本質形成中的作用越來越受到關注。但是DMP1在牙本質形成和牙髓損傷修復中的功能和調控的分子機制報道甚少。成牙本質細胞是如何形成DMP1?在形成時受哪些因子調控?它們間存在什么樣的相互作用?其作用機制又是如何?這些問題亟待解決。 DMP1是一種主要表達于牙本質和骨等礦化組織的基質蛋白，是一種新的富含絲氨酸的酸性磷酸化蛋白，組成中有1/3為門冬氨酸和谷氨酸，等電點為3.68。在不同的物種中，DMP1的基因結

3、構相似，具有高度同源性，并有一些高度保守區(qū)?，F(xiàn)有的研究表明：DMP1在體內發(fā)揮多重功能，既作為礦化調節(jié)蛋白，又作為一信號分子；過表達DMP1的細胞能夠誘導分化和促進礦化結節(jié)的形成；能夠結合鈣離子和膠原組織，在礦化過程中發(fā)揮啟動礦化的作用。DMP1基因敲除小鼠已經(jīng)建立，并且表現(xiàn)出牙髓腔增大，前期牙本質帶增寬，牙本質層變窄和礦化不全等癥狀。鑒于DMP1在牙本質礦化中的重要作用，研究其在牙本質形成中的具體作用機制，明確DMP1基因表達的調控方

4、式，對深入了解牙胚發(fā)育和牙髓損傷修復機理具有深遠的意義。 本研究采用PCR、細胞培養(yǎng)、報告基因、凝膠電泳遷移率分析(Electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)、定點突變等方法，從獲得與分析人DMP15'端功能性啟動子區(qū)序列入手，應用具有向成牙本質細胞分化潛能的人牙髓干細胞，初步探討DMP1基因的表達調控特點，找出在成牙本質細胞和成骨細胞中轉錄機制的差異，確定礦化組織特異性調控元件的基因位置和轉

5、錄因子的作用方式，以期揭示DMP1在成牙本質細胞分化和牙本質形成中的分子調控機制，為更深入研究DMP1的具體轉錄調控方式提供實驗依據(jù)。研究內容及主要結果如下： 第一部分人DMP1基因啟動子的克隆、序列測定及活性分析PCR法從人類基因組總DNA中克隆出DMP1基因啟動子-2109～+86bp長約2.2kb的部分啟動子區(qū)序列，并進行了生物信息學分析。通過PCR法將已獲得的人DMP1基因啟動子獲取不同長度的DMP1基因啟動子片段，并將

6、其構建至報告基因載體pGL3-Basic中，瞬時轉染至人牙髓干細胞(Humandentalpulpstemcell，HDPSC)、成骨細胞(Osteoblastcell，OC)和Hela細胞中，檢測這些細胞中DMP1的表達情況，分析不同片段啟動子在這些細胞中的轉錄活性并進行比較。結果發(fā)現(xiàn)，所獲得的序列正確，啟動子區(qū)存在多個活性片段和轉錄因子結合位點如Smads，F(xiàn)AST-1，Tcf/Lef-1，Cbfα1，同源盒基因En-1，Meis1

7、，Msx1、2，AP1、4等；DMP1主要表達于礦化性細胞胞漿中，啟動子活性具有礦化組織細胞特異性；初步定位了在HDPSC和OC中DMP1基本啟動子序列區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)其在HDPSC和OC中DMP1的轉錄調控存在差異。計算機分析啟動子-505～+86bp區(qū)發(fā)現(xiàn)，在DMP1基因啟動子上游-505～+86bp存在較多的轉錄因子結合位點或潛在的結合位點，其中包括Smads、AP1、Cbfα1等參與成牙本質細胞分化和特異性蛋白表達調控的轉錄因子。

8、 第二部分人DMP1基因在人牙髓干細胞中表達調控研究通過建立體外培養(yǎng)的HDPSC體外礦化誘導模型，運用RT-PCR、組織染色等法檢測細胞礦化誘導后DMP1mRNA表達、細胞形態(tài)學和礦化能力的變化以及對pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86兩個片段轉錄活性的影響。結果發(fā)現(xiàn)，HDPSC在礦化誘導液的作用下，能夠向成牙本質細胞方向分化，出現(xiàn)成牙本質細胞樣細胞表型。與對照組相比較，隨著誘導時間的延長，細胞內ALP活性

9、增強，較早的出現(xiàn)了礦化結節(jié)，說明在誘導液作用下礦化能力有了明顯的提高。誘導后的細胞出現(xiàn)了DMP1mRNA水平增高，pGL3-P-193～86和pGL3-P-505～+86活性均出現(xiàn)增強的趨勢，尤其以pGL3-P-505～+86活性增強更明顯。 誘導礦化后具有部分成牙本質細胞樣特征的HDPSC經(jīng)10ng/L人重組TGF-β1刺激后，細胞內DMP1mRNA的表達水平明顯下降，并存在時間依賴性。pGL3-P-193～+86和pGL3-

10、P-505～+86轉錄活性均下降，以pGL3-P-505～+86活性下降更明顯。結合DMP1基因啟動子-505～+86bp區(qū)的具體結合位點分析結果可得出，在啟動子-505～-193bp區(qū)存在TGF-β1下游作用分子或轉錄因子的結合位點，這些位點通過與相應的作用因子相結合可能參與TGF-β1下調DMP1轉錄表達過程。計算機分析結果發(fā)現(xiàn)，DMP1基因啟動子-505～+86bp區(qū)存在多個Smad結合位點，推測TGF-β1下調DMP1可能是通過

11、Smad分子來介導的。 進一步實驗觀察了瞬時轉染Smad3至HDPSC后的情況，結果發(fā)現(xiàn)，Smad3主要表達于細胞胞漿中，隨著TGF-β1刺激不同時間后，Smad3在細胞中的表達出現(xiàn)從胞漿到胞核的轉位過程，提示Smad3參與TGF-β1信號途徑，并且在轉染Smad3后的細胞中出現(xiàn)了pGL3-P-193～+86和pGL3-P-505～+86啟動子活性降低。進一步證實了在Smad3存在的條件下，TGF-β1下調DMP1的轉錄表達更明

12、顯，尤其是對pGL3-P-505～+86活性下降更顯著，明確了在DMP1基因啟動子-505～-193bp區(qū)的確存在Smad3結合位點。 結合計算機分析結果，針對Smad3結合區(qū)域-209～-201bp區(qū)GTCTAGTCA序列，設計了寡核苷酸探針以及其突變探針，利用EMSA對Smad3在人DMP1基因啟動子-505～-193bp上可能的結合位點GTCTAGTCA序列進行了初步定位。結果發(fā)現(xiàn)，標記的DMP1野生型探針可以與核蛋白結合

13、，形成滯后條帶，在TGF-β1的作用下，條帶更加明顯；在加入競爭性非標記探針后，未見滯后條帶形成；而突變型探針在有無TGF-β1作用下，由于個別位點的改變不能和核蛋白結合，故均未出現(xiàn)明顯滯后條帶。Smad3抗體與核蛋白共孵育后，出現(xiàn)了更加滯后的條帶。證明了Smad3與DMP1基因啟動子上的結合位點，并且明確了TGF-β1可以通過Smad3的SBE結合位點-209～-201bp區(qū)GTCTAGTCA序列與人DMP1基因啟動子相互結合，從而發(fā)

14、揮其對DMP1的下調作用。 第三部分Cbfα1和AP1對人DMP1基因轉錄調控的作用分析發(fā)現(xiàn)，DMP1基因啟動子-505～+86bp區(qū)也存在成牙本質細胞分化重要的轉錄調控因子Cbfα1和AP1的作用位點，通過免疫組化、細胞轉染、報告基因檢測系統(tǒng)及的定點突變等方法對Cbfα1和AP1對DMP1基因轉錄調控作用進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，誘導后的HDPSC中均少量表達Cbfα1、c-Jun和c-Fos，在瞬時轉染三者后，蛋白主要表達于細胞

15、胞漿中，并且在轉染48h后表達量均達到最高值；pGL3-P-505～+86分別與PCMV-Osf2、pRSV-c-Jun和pRSV-c-Fos共轉染至HDPSC后發(fā)現(xiàn)，Cbfα1可明顯增強pGL3-P-505～+86啟動子活性(P＜0.05)，而c-Jun和c-Fos能夠降低pGL3-P-505～+86啟動子活性，以c-Jun作用更為顯著(P＜0.05)。 為進一步驗證它們對DMP1是否具有直接的轉錄調控作用，對Cbfα1與c-

16、Jun/c-Fos結合位點(分別為TTGGGAACCACAAGA，-199～-185bp和TGTCAGTCACC，-110～100bp)進行定點基因突變，雙酶切和DNA測序鑒定突變效果，并將突變后的質粒與pGL3-P-505～+86共轉染至HDPSC中，檢測蟲螢光素酶活性。結果證實，Cbfα1與c-Jun/c-Fos對DMP1轉錄表達具有直接的調控作用，并且推測它們在轉錄水平上可能與其它因子存在交聯(lián)作用而共同參與DMP1的轉錄調控過程。