1、大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）是以蘭科蘭屬植物為親本，通過雜交育種培育成的品種群，具有極高的觀賞價(jià)值和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為五大盆栽蘭花之一，是重要的切花種類之一。近年來，世界多種蘭花的栽培和生產(chǎn)受病毒危害嚴(yán)重，其中建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)是造成危害最為嚴(yán)重的兩種重要病毒，可導(dǎo)致植株生長(zhǎng)不良、

2、花期縮短，開花質(zhì)量和數(shù)量下降，嚴(yán)重影響花卉的觀賞價(jià)值，制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，培育大花蕙蘭抗病毒新品種已成為育種的主要方向。由于蘭花抗病毒種質(zhì)資源的匾乏，育種周期漫長(zhǎng)，導(dǎo)致蘭花抗病毒育種一直處于停滯狀態(tài)，基因工程技術(shù)的應(yīng)用為其開辟了一條新的道路。
　　本研究對(duì)建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因進(jìn)行了克隆，分別構(gòu)建了2種病毒外殼蛋白基因的pBI121表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介

3、導(dǎo)法對(duì)大花蕙蘭進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。同時(shí)，建立靈敏、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)方法。為利用基因工程技術(shù)進(jìn)行蘭花抗病毒育種提供了參考，為以后的蘭花新品種培育提供了種質(zhì)資源。
　　1、本研究克隆了建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒兩種病毒的外殼蛋白基因，CymMVCP基因序列和ORSV CP基因序列與NCBI上的基因序列(AB197937，DQ915440)相似度均高達(dá)99％。
　　2、構(gòu)建了CymMV CP基因與ORSV CP基

4、因的表達(dá)載體pBI121-CymMVCP和pBI121-ORSVCP，通過農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)對(duì)大花蕙蘭受體材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。
　　3、以表達(dá)載體pBI121-CymMVCP和pBI121-ORSVCP為模板，建立了普通PCR、巢式PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)體系，并對(duì)LAMP體系中的dNTPs濃度、內(nèi)外引物的濃度比例和Bst DNA聚合酶加入量等條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:0.5mmol·L-1 dNTPs、

5、0.8μmol·L-1的內(nèi)引物、0.2μmol·L-1的外引物、4 U Bst DNA聚合酶大片段、2.5μL的10×ThermoPol Buffer以及10 ng的質(zhì)粒模板。
　　4、以重組表達(dá)載體質(zhì)粒作模板，普通PCR，巢式PCR和LAMP的最低檢出濃度分別為5.0×10-4 ng·μL-1，5.0×10-7 ng·μL-1和5.0×10-10 ng·μL-1;結(jié)果表明，巢式PCR方法的靈敏度是普通PCR方法的1000倍左右，