1、近年來，環(huán)境內分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)對人類的危害日益引起公眾和學術界的重視，在國際上已經成為毒理學界的研究熱點。五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)對水生生物的生長、發(fā)育和繁殖構成威脅，破壞了水生生態(tài)系統，并通過食物鏈進入人體，對人體健康有潛在的危害。因此在細胞水平上利用多個評價指標研究PCP對細胞的毒性效應具有重要的意義。到目前為止，PCP的內分泌干

2、擾作用的具體機制還不清楚。雌激素受體(ER)有兩種亞型：ERα和ERβ，PCP是通過ERα或ERβ其中一條途徑還是通過這兩條途徑來行使內分泌干擾作用至今未有報道。本實驗研究PCP是否通過與ERα結合來行使內分泌干擾作用，為進一步闡述PCP內分泌干擾作用的具體機制奠定基礎。實驗分為兩大部分：
　　 第一部分：通過觀察細胞形態(tài)學變化和測定細胞增殖抑制率、細胞DNA損傷以及乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、細胞培養(yǎng)液SOD活性變化多項評價指

3、標研究了PCP對HeLa細胞的毒性效應。
　　 通過細胞形態(tài)學觀察，初步確定在10-5mol/L PCP開始對HeLa細胞的形態(tài)學產生影響；然后確定細胞接種的數目在6000～10000個/孔時，可以很好地反映實驗結果，為后續(xù)實驗奠定基礎；利用MTT比色法測定PCP對HeLa細胞增殖抑制率的影響，確定了PCP半數抑制濃度IC50為66.59μmol/L，16.47μmol/L PCP染毒HeLa細胞24 h，細胞增殖抑制顯著，表明

4、線粒體己受到損傷，并且隨著PCP濃度的增加，細胞增殖抑制率增大，線粒體的損傷程度愈高。
　　 應用單細胞凝膠電泳技術研究了6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L PCP染毒24 h和36 h對HeLa細胞DNA的損傷情況。實驗結果表明，無論染毒24 h還是36 h，三個劑量的PCP均沒有造成HeLa細胞尾部DNA百分率和尾距的顯著增加，提示PCP對HeLa細胞DNA沒有損傷作用。
　　 在4個染毒H

5、eLa細胞時間下(12 h、24 h、36 h、48 h)，12.5μmol/L PCP濃度的細胞LDH漏出率很低，隨著PCP濃度的增加，細胞LDH漏出率逐漸增大，各PCP濃度組與12.5μmol/L PCP濃度組間均存在顯著性的差異(p＜0.05)，200μmol/L PCP使細胞LDH漏出率達到了90％。25μmol/L的PCP已經使HeLa細胞膜受到顯著性損傷，在一定的PCP濃度下(實驗濃度25μmol/L PCP和50μmol/

6、LPCP)，染毒時間與HeLa細胞LDH漏出率呈現出一定的時間-效應關系。LDH漏出率是評價PCP對HeLa細胞毒性的敏感指標之一。
　　 實驗研究發(fā)現12.25μmol/L、17.5μmol/L和25μmol/L PCP濃度組與溶劑對照組相比，細胞培養(yǎng)液SOD活性存在顯著性差異(p＜0.05)，并且隨著PCP濃度的增加SOD活性逐漸下降，存在一定的濃度-效應關系。HeLa細胞的4個染毒時間的細胞培養(yǎng)液SOD活性具有顯著性差異(

7、p＜0.05)，具有一定的時間-效應關系。相比細胞LDH漏出率，細胞培養(yǎng)液SOD活性是評價PCP對HeLa細胞毒性的更敏感指標。
　　 第二部分：通過建立的hERα細胞篩選系統，初步研究發(fā)現PCP是一種具有弱雌激素活性的內分泌干擾物，PCP可以通過ERα結合形成配體-受體復合物，發(fā)生構象改變并同型二聚體化，同型二聚體化的復合物可以和DNA分子上的雌激素反應元件(ERE)結合，激活受ERE調控的熒光素酶基因，熒光素酶基因轉錄形成m

8、RNA，mRNA進一步翻譯為熒光素酶(Luciferase，Luc)，通過測定熒光素酶活性可以間接反映PCP的內分泌干擾作用。PCP可以和17β-乙炔雌二醇(17β-ethinylestradiol，EE2)競爭結合ERα，PCP濃度越大競爭結合ERα的能力越強，同時與EE2共同誘導Luc表達的水平降低。
　　 本實驗結果表明：PCP染毒HeLa細胞，可以改變細胞形態(tài)，10-4mol/L PCP造成絕大部分的HeLa細胞死亡；P