1、目的:紫草是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,具有清熱,解毒的功效。千百年來(lái)被用于治療斑疹,麻疹,咽喉痛,癰以及燒傷。近期內(nèi)有臨床研究表明紫草對(duì)于治療癌癥特別是肝癌和肺癌具有較好的效果,本文的目的即是研究紫草有效成分抗癌作用的分子機(jī)制。
　　 方法:本課題為研究紫草及其衍生物對(duì)癌細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制,在藥理學(xué)作用觀察方面采用MTT作用于活細(xì)胞中的呼吸鏈,表征藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響,來(lái)考查其對(duì)癌細(xì)胞的的生長(zhǎng)抑制作用。同時(shí)用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,觀

2、察藥物作用下癌細(xì)胞的細(xì)胞核是否呈現(xiàn)染色質(zhì)邊緣化,出現(xiàn)凋亡小體,核固縮等凋亡形態(tài)。為進(jìn)一步研究靶標(biāo)藥物促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,采用Ligand Binding分析其與RXR蛋白的配體9-cis的競(jìng)爭(zhēng)性親和效應(yīng),3H標(biāo)記的9-cis在閃爍液中的cpm值可以量化紫草中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RXR蛋白成分的結(jié)合能力。另外Western Blotting的方法研究不同濃度軟紫草提取物處理后對(duì)癌細(xì)胞RXR蛋白穩(wěn)定性的影響。為選出一個(gè)具有代表性的紫草成分及其衍

3、生物,再次采用MTT assay的方法對(duì)紫草提取物中的主要成分及其衍生物在不同濃度下對(duì)肺癌細(xì)胞H460的增殖抑制情況,比較其生長(zhǎng)抑制曲線,選擇了效果最為明顯的SK02作為我們進(jìn)一步研究的單組分藥物,來(lái)進(jìn)行更多的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)中我們通過轉(zhuǎn)染RXR表達(dá)載體進(jìn)CV-1細(xì)胞,篩選得到的一個(gè)穩(wěn)定高表達(dá)RXR蛋白的細(xì)胞系,通過在該細(xì)胞系上進(jìn)行MTT檢測(cè)來(lái)研究藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與RXR蛋白的關(guān)系。同樣用3H標(biāo)記的9-cis確認(rèn)了SK02與R

4、XR的結(jié)合能力后,還采用糜蛋白酶酶切被SK02處理前后的重組RXR-LBD,觀察其LBD區(qū)域是否會(huì)因?yàn)槠浣Y(jié)合而發(fā)生構(gòu)型變化,表現(xiàn)在Western Blot上條帶的變化。為進(jìn)一步研究藥物的作用機(jī)制,我們采用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報(bào)告基因分析(CAT assay)考查靶標(biāo)藥物對(duì)RXR蛋白的同源轉(zhuǎn)錄激活以及和TR3,RAR的異源轉(zhuǎn)錄激活作用:同時(shí)用RXRα的表達(dá)載體和含RXRα結(jié)合位點(diǎn)的CAT報(bào)告基因(TREpal)轉(zhuǎn)染CV1細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后分別用不同

5、濃度的SK02和RXRα的特異性配體SR11237處理24小時(shí),CAT分析檢測(cè)RXRα的轉(zhuǎn)錄效率；同樣的在異源轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)中,同時(shí)用RXRα的表達(dá)載體,表達(dá)RAR或者TR3的載體。和含RXRα結(jié)合位點(diǎn)的CAT報(bào)告基因(TREpal)轉(zhuǎn)染CV1細(xì)胞,3H標(biāo)記的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cpm除以考查轉(zhuǎn)染效率的β-gal值,即是藥物影響下的轉(zhuǎn)錄效率。
　　 結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)1紫草粗提物能有效抑制肺癌細(xì)胞H460的生長(zhǎng),而同時(shí)加入9-

6、cis-RA(RXR的天然配體)減弱了這種生長(zhǎng)抑制作用；2配體親和實(shí)驗(yàn)表明紫草粗提物中含有可與RXR結(jié)合的成分,在1 ug/ml的濃度下就能把半數(shù)結(jié)合上去的[3H]9-cis-RA競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)；3經(jīng)過不同濃度的紫草粗提物處理,H460中RXR的含量出現(xiàn)劑量依賴性的下降,說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞中RXR蛋白穩(wěn)定性的影響；4進(jìn)一步研究紫草中作用的主要成分之-SK02組分,發(fā)現(xiàn)其對(duì)穩(wěn)定高表達(dá)RXR蛋白的CV-1細(xì)胞系具有更強(qiáng)的抑制作用；5 SK02其能與9-

7、cis競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RXR,在10-6M～10-4M間結(jié)合能力逐漸增強(qiáng),小于10-6M結(jié)合能力進(jìn)入平臺(tái)期；6 SK02與RXR的結(jié)合引起RXR LBD結(jié)構(gòu)域的變化,使得其對(duì)糜蛋白酶的敏感性增強(qiáng)；7SK02亦能抑制RXR的同源二聚體轉(zhuǎn)錄激活,以及與RXR/TR3,RXR/RAR的異源二聚體轉(zhuǎn)錄激活作用；8 SK02亦能促進(jìn)RXR的降解。
　　 結(jié)論:紫草的抗癌作用是通過其活性成分與核受體RXR蛋白結(jié)合,抑制RXR的轉(zhuǎn)錄激活并促進(jìn)RXR