1、一、研究背景
　　骨缺損的修復是骨科臨床常見和多發(fā)的棘手難題之一，傳統(tǒng)的自體及異體骨移植一直仍為首選，但均存在各自的缺點。磷酸鈣骨水泥(calciumphosphatecements，CPCs)作為新型的骨修復材料，具有可注射、塑形好、骨傳導性強等優(yōu)點，是一種新型自固化人工骨替代材料，但較慢的吸收降解率阻礙了其廣泛應用；目前人們在骨組織工程的研究中，期望rhBMP-2的參與能獲得比較理想的骨組織再生。但由于將BMP單純植入機體內擴

2、散太快，并且BMP易被蛋白酶水解，故不能在有效的時間內作用于更多靶細胞，生物學效能難以充分發(fā)揮，故BMP的臨床應用需要一定的緩釋載體。雖然通過將CPC直接負載骨生長因子治療骨缺損效果良好，但CPC的因子釋放能力有限。微球用于藥物載體的研究始于20世紀70年代中期，自此以后的研究發(fā)展十分迅速。目前生長因子及可降解的微球載體材料生物學的最新成就己經成功運用于軟骨、骨以及其他相關組織的組織工程研究中?？山到馕⑶驍y載因子后復合磷酸鈣骨水泥，在微

3、球降解成孔的同時使因子釋放率大大增加，明顯加速復合材料的降解和誘導成骨。目前主要以PLGA材料制備微球，但它仍存在較為緩慢的降解率及降解產物呈酸性易損傷周圍組織細胞的缺點，而明膠微球生物相容性好，降解后形成膠原，無毒副作用，有望代替PLGA作為磷酸鈣骨水泥的良好改性材料。
　　二、研究目的
　　采用無毒、可生物降解、生物相容性好的明膠作為載體材料，優(yōu)化的雙相乳化冷凝聚合法制備rhBMP-2/GMS，對其形態(tài)、粒徑、包封率、載

4、藥率進行檢測，測定其體外因子緩釋曲線，進一步將其負載于磷酸鈣骨水泥，制備多孔載因子CPC，在骨缺損模型體內，采用“生物力學特性-X線觀察-組織形態(tài)”的綜合手段，評估新型復合人工骨材料對骨缺損愈合的作用。
　　三、研究內容和方法
　　1基因重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/明膠微球(rhBMP-2/GMs)的制備及性質檢測根據(jù)天然明膠材料經京尼平處理后可交聯(lián)成球及可固化的特性，采用改進的雙相乳化冷凝聚合法制備rhBMP-2/GMs;<

5、br>　　檢測rhBMP-2/GMs載藥率及包封率，掃描電鏡觀察rhBMP-2/GMs形態(tài)及粒徑。
　　rhBMP-2/GMs體外釋藥實驗研究：以10ml無菌PBS作為釋藥介質，加入適當濃度的rhBMP-2/GMS溶液1ml，混合均勻后，放置于37℃恒溫水浴振蕩器中，記錄釋藥起始時間。分別于第1-10天吸取釋藥介質5ml，ELISA法測試藥物含量，并同時補充等量5ml介質，測量每個時間段所釋放的藥物總量，進行百分比統(tǒng)計，描繪藥物累

6、積釋藥曲線。
　　根據(jù)rhBMP-2/GMs載藥率和包封率計算出rhBMP-2含量后，以相同比例與CPC混合，分別將rhBMP-2/GMs/CPC組及rhBMP-2/CPC組各以5ml生理鹽水作為釋藥介質，分別于1、4、7、14、21、28天收集全部浸提液，ELISA法測定rhBMP-2的濃度，從而計算出各個時間點的累積釋藥量，描繪累計釋藥曲線。
　　2.rhBMP-2/GMs/CPC體內降解、誘導成骨實驗
　　制備復

7、合rhBMP-2/GMS/CPC(A組)、GMS/CPC(B組)和rhBMP-2/CPC(C組)，分別植入兔橈骨骨缺損模型中，術后6、12周行大體、X線檢查、骨密度檢查，術后12周處死動物，收集標本，分別行生物力學測定，脫鈣切片、HE染色，不脫鈣切片進行熒光顯微鏡下觀察雙標間距，計算平均礦化率。
　　3.統(tǒng)計學處理
　　實驗結果以x±s表示，組間差異比較分別采用方差分析和q檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異特別

8、顯著。
　　四、結果
　　1rhBMP-2/GMs性質檢測結果.
　　形態(tài)及粒徑：經圖像分析儀檢測，圓形規(guī)則，直徑為78±20μm，平均直徑為87.8μm。掃描電鏡觀察固化后的微球表面均勻、圓整，微球之間粘連少，分散性好。
　　載藥率及包封率：微球內藥物的包封率80.5％，微球載藥率為9.8％，即每毫克微球中含98μg。
　　穩(wěn)定性觀察：明膠微球在放置于4℃的恒溫冰柜6個月以后，倒置顯微鏡下觀察其外觀、形態(tài)

9、明顯無變化，無明顯粘連，再分散性良好，置于生理鹽水中后成乳狀液，散布均勻，無沉淀。
　　體外釋藥實驗:rhBMP-2/GMs微球釋藥結果表明微球的體外釋藥符合雙相動力學釋藥規(guī)律，即初相為快速釋藥相，后相為平穩(wěn)緩釋相。體外釋藥曲線可見約70％的rhBMP-2在10天左右釋放完成。兩種復合材料對比釋藥結果表明：rhBMP-2/GMs/CPC組的24小時體外釋放率為8.3±1.5％，隨后28天內逐漸緩慢釋放，不同時間點的釋放率均高于rh

10、BMP-2/CPC組。
　　2.rhBMP-2/GMs/CPC體內降解、誘導成骨實驗
　　X線檢查：術后第12周，A組骨缺損修復明顯快于B組、C組，且材料降解較B組快。骨密度檢測顯示術后6周三組未見明顯差異，但12周后A組明顯高于B、C組。組織病理學提示：術后12周材料周圍、鄰近區(qū)域A組的平均骨礦化率均明顯高于B組及C組。HE染色見術后12周A組復合材料大部分降解，內部可見大量新生骨組織生成，新生骨組織的形成量明顯高于B組、

11、C組，不脫鈣切片觀察：A組材料骨界面見雙條狀新骨熒光著色帶且距離較寬，新骨生成較多；B組見骨界面材料熒光著色極少，距離最窄；而C組片狀著色且距離相對較窄，說明材料周圍新骨生成相對不穩(wěn)定。
　　五、結論
　　1．探索出:rhBMP-2/GMs的最佳制備方法，所得方法制備工藝穩(wěn)定，重復性好。
　　2．rhBMP-2/GMs及rhBMP-2/GMs/CPC體外釋藥實驗均證明其具有良好的緩釋效果。
　　3.rhBMP-2