1、Ced-9是從動(dòng)物線蟲(chóng)(C.elegance)中克隆出來(lái)的抗凋亡基因,屬于Bc1-2家族,與哺乳動(dòng)物中的抗凋亡基因Bc1-2同源。前人的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)凋亡抑制基因Bc1-xl和Ced-9能夠促進(jìn)植物細(xì)胞對(duì)生物和非生物脅迫的抗性,但是其作用機(jī)制仍知之甚少。本研究以煙草為模式材料,開(kāi)展鋁(Al)、鹽誘導(dǎo)其細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)的研究,并通過(guò)轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡抑制基因Ced-9/Bcl-2提高煙草和水稻

2、的耐鋁抗鹽性及其機(jī)理分析,獲得如下主要結(jié)果： 1、用DNA ladder檢測(cè)證明了Al誘導(dǎo)的植物細(xì)胞死亡是類(lèi)似于凋亡的PCD過(guò)程。 2、通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草的相對(duì)根長(zhǎng)、蘇木精染色等指標(biāo),首次證明凋亡抑制基因Ced-9在煙草細(xì)胞內(nèi)具有一定的促進(jìn)耐Al功能。通過(guò)蘇木精染色比較轉(zhuǎn)基因和野生型煙草在不同Al濃度下根部Al積累量,證實(shí)Ced-9可緩解Al脅迫下煙草根部Al的積累量。研究表明過(guò)量表達(dá)Ced-9的轉(zhuǎn)基因煙草植株也表現(xiàn)出比

3、野生型更強(qiáng)的抗鹽能力。 3、用DNA ladder 檢測(cè)比較轉(zhuǎn)基因和野生型煙草在Al或鹽脅迫條件下的植物細(xì)胞PCD,發(fā)現(xiàn)Ced-9能阻斷Al或鹽誘導(dǎo)PCD的發(fā)生,從而提高煙草的耐脅迫能力。 4、研究發(fā)現(xiàn)Ced-9能通過(guò)下調(diào)植物細(xì)胞內(nèi)Al和鹽誘導(dǎo)的類(lèi)天冬氨酸依賴性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的液泡酶(vacuolar processing enzyme,VPE)的表達(dá)水平,抑制Al和鹽誘導(dǎo)的PCD發(fā)生。揭示PCD的負(fù)

4、調(diào)控可能是潛在的耐Al機(jī)制之一,并且PCD的負(fù)調(diào)控作用對(duì)植物細(xì)胞耐受非生物脅迫具有廣譜性。 5、用熒光探針DCFH和Fluo-3結(jié)合共聚焦熒光顯微技術(shù),發(fā)現(xiàn)Al能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增加。研究還發(fā)現(xiàn)凋亡抑制基因Ced-9不能抑制Al誘導(dǎo)的ROS增加,但能直接調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)水平。暗示Ced-9作用于Al脅迫引起的ROS信號(hào)的下游并延遲了Al激活的Ca2+

5、信號(hào)水平的升高。推測(cè)Ced-9在植物細(xì)胞中的耐Al機(jī)制可能是通過(guò)延遲細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)水平的升高來(lái)抑制Al引起的PCD。 6、研究表明Ced-9不直接上調(diào)受Al誘導(dǎo)的基因NtGDI1、parB,NtPox的表達(dá),這些基因的表達(dá)能抑制Al脅迫激發(fā)的ROS所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。說(shuō)明Ced-9不直接抑制Al脅迫引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。 7、此外,還將Ced-9和Bcl-2基因通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtume

6、faciens)EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻,獲得以下結(jié)果：(1)將Bcl-2小片段連接到中間載體pGEM上以獲得合適的酶切位點(diǎn),構(gòu)建中間載體pGEM-Bcl2,將酶切下來(lái)的Bcl-2小片段連接到載體pCAMBIA13011上,成功構(gòu)建了表達(dá)載體pCMBIA13011-Bc12。(2)將pCAMBIA13011-Bcl2以及實(shí)驗(yàn)室已有的pCAMBIA13011-Ced9通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻,用潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因種子篩選獲得抗性植株,并進(jìn)行P