1、目的： 胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，尤其在中國(guó)、韓國(guó)、日本等東亞國(guó)家。盡管胃癌的診斷和治療已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但進(jìn)展期胃癌的預(yù)后依然很差，5年生存率徘徊在20％～30％左右。在過(guò)去的幾年中，已經(jīng)證實(shí)胃癌的發(fā)生發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。胃癌中特殊基因的表達(dá)異常在不同的細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞粘附、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。更好的了解胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有利于胃癌的診治及預(yù)防。 許多研究表明生長(zhǎng)因子不僅

2、促進(jìn)組織細(xì)胞的增殖，而且能誘導(dǎo)組織細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，他們?cè)谌祟惸[瘤的發(fā)展中發(fā)揮了重要的角色。中期因子(Midkine，MDK，MK)是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族的成員。人MK基因定位于11p11.2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。其啟動(dòng)子區(qū)域有視黃酸反應(yīng)元件，因此視黃酸可誘導(dǎo)胚胎瘤細(xì)胞系和某些組織MK的表達(dá)。成熟的MK是一種分泌性蛋白，它在妊娠中期胎兒組織中分布廣泛，出生后表達(dá)水平降低。在正常成人組織中，MK在小腸黏膜高表達(dá)，在甲狀腺中度表達(dá)，

3、在肺、結(jié)腸、胃、腎及脾組織中微弱表達(dá)，而在肝臟完全不表達(dá)。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MK高表達(dá)于多種人類惡性腫瘤，如乳腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和Wilm's瘤等。這與其具有多種生物學(xué)功能有關(guān)，它不僅在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起到營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)作用，還能通過(guò)促有絲分裂、促血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抗凋亡等功能影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。 目前，關(guān)于MK與胃癌的關(guān)系研究較少。因此

4、，本研究旨在探討在人胃癌組織中MK的表達(dá)情況，并研究其在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及分子機(jī)制。 方法： 一、Midkine在人胃癌組織中的表達(dá) 1、利用免疫組化方法檢測(cè)MK在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)。 2、利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)MK在胃癌及其配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)。 二、Midkine影響胃癌細(xì)胞的增殖 1、利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)SGC7901、BGC823、MGC803、MKN1

5、胃癌細(xì)胞系中MK表達(dá)。 2、利用分子克隆方法構(gòu)建MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。 3、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及空載體轉(zhuǎn)染人胃癌SGC7901細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定克隆后進(jìn)行鑒定。 4、MK靶向siRNA瞬時(shí)干涉人胃癌BGC823細(xì)胞內(nèi)源性MK表達(dá)。 5、利用MTT法及臺(tái)盼蘭拒染法檢測(cè)MK高表達(dá)對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響。 6、利用MTT法檢測(cè)靶向干涉MK后對(duì)BGC8

6、23細(xì)胞增殖的影響。 7、通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)MK對(duì)SGC7901細(xì)胞克隆形成能力的影響。 8、通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)MK對(duì)SGC7901細(xì)胞體內(nèi)成瘤性的影響。 三、Midkine影響胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制 1、利用Western blot檢測(cè)MK對(duì)兩條主要生存通路(PI3K/Akt，ERK1/2)的影響。 2、利用Western blot檢測(cè)MK對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclinA，cyc

7、linB1，cyclinD1，Cdk2，Cdk4，Cdk6)的影響。 結(jié)果： 一、Midkine在人胃癌組織中的表達(dá) 1、免疫組化結(jié)果顯示：MK在胃癌組織的陽(yáng)性率為54％，而在癌旁正常組織的陽(yáng)性率僅為28％(P<0.05)。 2、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：在19對(duì)人胃癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本中，有11例標(biāo)本MK在胃癌組織的表達(dá)為癌旁正常組織的2倍以上(57.7％)，而僅有2例標(biāo)本MK在癌旁正常組織的表

8、達(dá)為胃癌組織的2倍以上(10.5％)，(P<0.05)。 二、Midkine影響胃癌細(xì)胞的增殖 1、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果示：四種胃癌細(xì)胞系，按MK mRNA水平由高至低排序?yàn)锽GC823>MGC802>MKNl>SGC7901。 2、經(jīng)BamHⅠ及EcoRⅠ雙酶切MK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體得到大小分別為6Kb及400bp左右片段，初步證實(shí)載體結(jié)構(gòu)正確，DNA測(cè)序后與GeneBank公布的MK cDNA比對(duì)證實(shí)MK基因序列正

9、確、完整。 3、經(jīng)G418篩選后獲得兩個(gè)MK穩(wěn)定高表達(dá)的SGC7901細(xì)胞克隆。實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果示，7號(hào)和11號(hào)克隆MK mRNA及蛋白表達(dá)水平均較空載體對(duì)照組高5倍以上，且7號(hào)克隆高于11號(hào)克隆。 4、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果示：10nM及20nM MK siRNA靶向干涉后，BGC823細(xì)胞內(nèi)源性MK表達(dá)分別降低了46.9％和74.8％。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果一

10、致。 5、應(yīng)用MTT法及臺(tái)盼蘭拒染法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示：從72h開始，7號(hào)、11號(hào)克隆的增殖速率均高于空載體對(duì)照組，且7號(hào)克隆高于11號(hào)克隆。 6、應(yīng)用MTT法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，從從48h開始，MK靶向干涉組增殖速率明顯低于無(wú)關(guān)序列干涉組，且20nM靶向干涉組低于10nM干涉組。 7、集落形成實(shí)驗(yàn)表明，三周后7號(hào)克隆形成集落最多，其次為11號(hào)克隆，空載體對(duì)照組形成集落最少。 8、裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表

11、明，皮下注射三周后無(wú)論腫瘤體積還是瘤體重量，7號(hào)克隆最大，11號(hào)克隆次之，二者均較空載體對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 三、Midkine影響胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制 1、Western Blot結(jié)果示：MK高表達(dá)的7號(hào)、11號(hào)克隆，Akt及ERK的磷酸化水平明顯上調(diào)；相反，在10nM及20nM MK siRNA靶向干涉組，Akt及ERK的磷酸化水平下降。Akt及ERK蛋白水平均無(wú)變化。 2、Western Blot結(jié)果示：

12、MK高表達(dá)的7號(hào)、11號(hào)克隆，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(cyclinA，cyclinD1，Cdk2，Cdk4，Cdk6)表達(dá)水平明顯上調(diào)；相反，在10nM及20nM MK siRNA靶向干涉組，這些蛋白的表達(dá)水平下降。 結(jié)論： 1、胃癌組織中MK表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。 2、MK能夠在體外和體內(nèi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。 3、MK通過(guò)激活PI3K/Akt及ERK1/2兩條主要生存通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。 4、M