1、成纖維生長因子受體3(Fibroblastgrowthfactorreceptor3)是受體酪氨酸激酶FGFRs家族成員之一。FGFR3功能增強型點突變可導致多種骨骼發(fā)育不良性遺傳疾病,包括軟骨發(fā)育不良(Achondroplasia,ACH),季肋發(fā)育不良(Hypochondroplasia,HCH)及致死性軟骨不全(Thanatophoricdysplasia,TD)。這些疾病多表現(xiàn)為軟骨內(nèi)成骨過程發(fā)生變化。模擬人ACH的FGFR3功

2、能增強小鼠(Fgfr3G369C/+)個體短小、頭顱短圓、長骨生長板組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,進一步觀察發(fā)現(xiàn)其軟骨細胞增殖帶短稀,軟骨細胞增殖能力減弱、肥大軟骨細胞明顯減少。相反,FGFR3基因敲除小鼠(Fgfr3-/-)則表現(xiàn)為長骨過度生長,生長板軟骨增殖、肥大帶變寬、軟骨細胞增殖活性增加。上述結(jié)果表明,FGFR3是軟骨內(nèi)成骨過程的負性調(diào)節(jié)因子,它主要通過抑制軟骨細胞增殖、分化來阻遏骨骼發(fā)育過程中的軟骨內(nèi)成骨過程。
　　除影響軟骨內(nèi)成骨

3、外,目前有較多線索提示FGFR3可直接參與調(diào)控骨形成。Fgfr3-/-小鼠長骨鈣化障礙,骨密度降低、骨質(zhì)減少,易骨折;ACH小鼠骨小梁厚度及數(shù)量減少,礦化受抑制,Cbfa1、OC、OP等表達增強,提示FGFR3功能增強促進骨形成。FGFR3在成骨細胞中表達較低,但骨形成卻有明顯改變,且Fgfr3-/-小鼠與ACH小鼠都存在骨量減少的表型。近年研究發(fā)現(xiàn),軟骨細胞可分泌IHH、BMP4等分子影響成骨細胞進而影響骨小梁的發(fā)生。軟骨內(nèi)激活突變C

4、ol2-Fgfr3Y367C/+及全身激活突變小鼠CMV-Fgfr3Y367C/+表型類似。上述提示FGFR3在直接影響成骨細胞同時也可通過軟骨細胞間接影響骨形成。
　　骨折愈合過程與骨發(fā)育過程類似。許多骨折愈合的研究也同樣表明FGFR3參與其中。FGFR3在負性調(diào)節(jié)骨發(fā)育的同時,同樣能夠抑制軟骨形成從而延緩骨折愈合過程。那么在軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠中,其骨折愈合過程是否存在變化?
　　綜上,我們通過建立軟骨內(nèi)敲除FG

5、FR3小鼠(FGFR3fl/fl-Col2Cre),觀察其骨骼表型變化,并制作小鼠脛骨穩(wěn)定性骨折模型觀察其骨損傷修復,結(jié)合BMSC分化誘導等細胞學實驗探討FGFR3通過軟骨間接影響骨形成及骨折愈合的機制。
　　主要實驗方法:
　　一、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失對骨形成影響
　　1.測量Fgfr3fl/fl-Col2Cre體重、身長、股骨長度、脛骨長度及尾長比較其和野生型發(fā)育情況;
　　2.利用Micro-CT及X光

6、等手段分析Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠股骨骨量等指標,明確Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠在成年期骨量變化;
　　3.通過全骨架染色觀察Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠早期形態(tài)變化及顱底軟骨連接有無改變,通過全骨架染色觀察次級骨化中心出現(xiàn)時間有無改變,利用藏紅固綠染色及H&E染色觀察生長板形態(tài)變化;
　　4.利用原代成骨細胞培養(yǎng)及BMSC了解礦化及成骨活性等指標變化;
　　5.通過TRAP染

7、色并進行形態(tài)計量從而觀察破骨細胞功能活性有無改變確定引起骨形成改變的原因;
　　6.利用原代軟骨細胞培養(yǎng)定量檢測軟骨細胞分泌IHH、BMP、VEGF、Noggin等信號分子表達進而確定軟骨細胞影響成骨細胞的可能機制。
　　二、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失對骨折愈合影響
　　1.建立小鼠脛骨穩(wěn)定性骨折模型;
　　2.利用X線掃描及Micro-CT確定骨折愈合快慢有無變化;
　　3.利用藏紅固綠及H&E染色觀察骨折

8、斷端細胞形態(tài);
　　主要實驗結(jié)果:
　　一、Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠通過間接作用引起骨形成改變
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠早期及成年期形態(tài)均存在形態(tài)改變,鼠尾彎曲變形;
　　2.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨形成過程加快
　　1)X光及Micro-CT掃描分析Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠在1m齡及4m齡均骨量增加,骨小梁區(qū)域長度增加。
　　

9、2)Fgfr3fl/fl-Col2Cre生次級骨化中心出現(xiàn)延遲但顱底軟骨連接閉合無明顯變化。生長板增殖軟骨細胞活性增強,肥大軟骨細胞帶增寬。
　　3)鈣黃綠素熒光雙標檢測Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨形成速率增加。
　　4)原代成骨細胞檢測發(fā)現(xiàn)ALP活性無變化,礦化無障礙。BMSC誘導成骨細胞后檢測礦化無障礙,但ALP活性降低,增殖減慢。
　　3.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠破骨細胞數(shù)量減少,破

10、骨細胞活性降低;
　　4.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失后間接影響骨形成
　　原代軟骨細胞培養(yǎng)后定量PCR檢測mRNA表達,IHH表達升高,VEGF降低,BMP2/7無明顯差異但BMP抑制分子Noggin表達降低。
　　二、Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨折愈合加快
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨折愈合加快
　　X線及Micro-CT掃描發(fā)現(xiàn),Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠

11、在術(shù)后7天時已進入骨痂形成期,而野生型小鼠仍處于血腫機化期。在術(shù)后14d時Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠已有鈣化骨痂出現(xiàn)而野生型小鼠仍以大量軟骨痂覆蓋于骨折斷端。術(shù)后21d時Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠已幾乎愈合而野生型小鼠仍有大量骨痂存在。
　　2.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠軟骨細胞增殖活性增加,肥大軟骨細胞功能增強
　　藏紅固綠及H&E染色結(jié)果可見,在術(shù)后7天Fgfr3fl/fl-Co

12、l2Cre小鼠骨折斷端周圍出現(xiàn)肥大軟骨細胞;野生型小鼠骨折斷端處則主要是增殖軟骨細胞。術(shù)后14天可見Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠骨痂內(nèi)可見松質(zhì)骨形成,其周圍附著大量肥大軟骨細胞,增殖軟骨細胞少見;野生型小鼠軟骨痂明顯較少,增殖軟骨細胞較多,新生松質(zhì)骨少見。在術(shù)后21天,Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠形態(tài)已接近恢復僅存在少量肥大軟骨細胞;而野生型小鼠軟骨痂中仍有大量肥大軟骨細胞。
　　主要結(jié)論:
　　一、

13、軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠骨形成加快
　　1.Fgfr3fl/fl-Col2Cre小鼠四肢過度生長,鼠尾彎曲,骨量增加骨量增加;
　　2.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠骨形成過程加快,次級骨化中心出現(xiàn)延遲,顱底軟骨連接無改變,顱骨成骨細胞礦化無障礙,成骨活性無改變,BMSC礦化無障礙,ALP總活性降低但定量結(jié)果升高;生長板中肥大軟骨細胞帶增寬,增殖軟骨細胞活性增強,骨形成速率加快;
　　3.軟骨內(nèi)FGFR3功能缺失小鼠