1、研究背景：丙氨酸氨基轉移酶是人血清中的一種重要的催化酶，在蛋白質(zhì)分解代謝中起氨基轉移作用。它主要存在于肝細胞漿內(nèi)，肝細胞損傷時，大量的ALT釋放入血，所以丙氨酸氨基轉移酶是反映肝損傷的敏感的指標。為減少輸血傳播疾病的發(fā)生，我國衛(wèi)生部規(guī)定，血清ALT檢驗是獻血員健康體檢必查項目之一，而我國每年由于ALT不合格造成的采血后血液報廢率達6-8％。面對現(xiàn)在街頭無償獻血者因血清ALT高造成大量不必要的獻血和血液浪費問題，非常有必要建立一種快速靈敏

2、、準確方便的ALT檢測方法。目前街頭獻血者ALT的篩查均采用速率法和化學干粉法。但這兩種方法存在的主要問題是反應時間長，需要特殊設備，受環(huán)境因素影響大。免疫金標法具有操作簡便、快速、特異性強，不需要特殊設備，易觀察結果等優(yōu)點，因此我們探索ALT免疫金標快速檢測試劑的研制，而高特異性抗ALT單克隆抗體的制備是該試劑研制的關鍵步驟。 目的：獲得分泌高特異性抗ALT單克隆抗體的雜交瘤細胞株；制備針對ALT的單克隆抗體并對其特性進行鑒定

3、。 方法：用含50％福氏佐劑的豬TLT純品(20μg)腹部皮下免疫Balb/C小鼠，共4次，免疫間隔為2周。間接ELISA法測抗體效價。取效價滿意鼠的脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞進行融合，用含HAT和HT的培養(yǎng)液選擇性培養(yǎng)，用高ALT人血清作檢測原，采用間接ELISA法測定培養(yǎng)上清中抗體分泌情況，陽性孔經(jīng)三次有限稀釋法克隆化，得到的陽性雜交瘤細胞株腹腔接種于預注射降植烷的Balb/C小鼠，收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法進行純化

4、。 采用間接ELISA法測定腹水中效價和親和力：秋水仙素阻斷法進行雜交瘤細胞染色體分析；用SouthernBiotech公司的單克隆抗體亞類鑒定試劑鑒定單抗亞類；SDS-PAGE電泳測定單抗的分子量；用Westernblotting分析單克隆抗體的特異性；將純化后單抗用辣根過氧化物酶標記，建立雙抗體夾心ELISA檢測人血清中的ALT的方法。 結果：采用傳統(tǒng)的細胞融合技術得到1株分泌抗人ALT單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其染

5、色體數(shù)目為95～106。其分泌的抗體為IgG1，輕鏈為κ型。上清和腹水中抗體效價分別為10-4和10-6。SDS-PAGE顯示該抗體在55KD和25KDWesternblotting結果顯示該株McAb可與人血清中的ALT特異地結合。人血清標本和ALT質(zhì)控品的雙抗體央心ELISA結果和生化分析儀結果基本一致。 結論：本研究獲得了一株能穩(wěn)定分泌ALT單克隆抗體特異性的雜交瘤細胞株，該株單抗有很好的親和力，能特異性地識別人血清中的A