1、近十幾年來(lái)，禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)特別是H9N2亞型AIV在中國(guó)廣泛流行，給中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已有研究發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV不經(jīng)適應(yīng)即可感染哺乳動(dòng)物，包括小鼠、豚鼠、雪貂、恒河猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以及家貓、家犬等伴侶性動(dòng)物。更重要的是，我國(guó)已發(fā)生H9N2亞型禽流感感染人的事件。血清學(xué)調(diào)查也顯示，我國(guó)農(nóng)場(chǎng)從業(yè)人員的血清中抗H9亞型流感病毒的陽(yáng)性率達(dá)2.3％-13.7％。上述現(xiàn)象說(shuō)明H9N2亞

2、型AIV已經(jīng)獲得跨越種間屏障進(jìn)而感染哺乳動(dòng)物甚至是人的能力，因而具有引發(fā)新的流感大流行的潛在威脅。在廣泛流行的同時(shí)，H9N2亞型AIV作為新發(fā)流感病毒的基因節(jié)片供體為其它亞型AIV提供了多個(gè)基因節(jié)片。如1997年香港流行的H5N1亞型流感病毒，其內(nèi)部基因可能來(lái)源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分離株，而2013年流行的H7N9亞型AIV的內(nèi)部基因全部來(lái)自H9N2亞型AIV。因此，加強(qiáng)對(duì)中國(guó)H9N2亞型AIV跨

3、種感染與致病機(jī)制研究，對(duì)保障養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和保護(hù)人類健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究從分析H9N2亞型AIV的受體結(jié)合特性與致病機(jī)制入手，主要進(jìn)行了以下兩方面的工作:
　　首先，分析了中國(guó)近十幾年間流行的H9N2亞型AIV受體結(jié)合特性。我們分析了中國(guó)1999～2014年間在NCBI上提交的H9N2亞型AIV的HA序列與病毒受體結(jié)合能力有關(guān)的HA蛋白第226位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)相應(yīng)病毒株的宿主分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，中國(guó)流行的H9N

4、2流感病毒其HA-226位點(diǎn)已呈現(xiàn)出遺傳演化的多樣性，除了常見(jiàn)的L和Q位點(diǎn)外，又出現(xiàn)了M和F，其所占比率分別為81.85％、17.57％、4.81％和0.11％;宿主分布結(jié)果表明，中國(guó)的H9N2亞型AIV絕大部分來(lái)自于禽類，剩下的分別來(lái)自于豬和人，其所占比率分別為97.92％、1.81％和0.27％。另外，分別利用雞紅細(xì)胞法和固相ELISA方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的三株H9N2亞型AIV的受體結(jié)合能力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，具有HA-226L的病

5、毒（CK/JN/3）只具有結(jié)合SAα2，6Gal的能力;具有HA-226Q的病毒(CK/JL/6)只具有結(jié)合SAα2，3Gal的能力;而具有HA-226F的病毒(CK/JN/2)則具有雙重受體結(jié)合特性。而當(dāng)前中國(guó)家禽中所流行的H9N2亞型流感病毒以具有結(jié)合SAα2，6Gal的病毒為主。上述結(jié)果說(shuō)明中國(guó)H9N2亞型AIV大部分毒株已具備了識(shí)別人樣流行病毒受體的能力，在哺乳動(dòng)物間流行的風(fēng)險(xiǎn)在加大。
　　另一方面，本實(shí)驗(yàn)分析了H9N2亞

6、型AIV內(nèi)部基因突變對(duì)病毒致病性的影響。利用點(diǎn)突變技術(shù)將在小鼠適應(yīng)株中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)部基因3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)（PB2-E627K、 HA-N313D和HA-N496S）依次引入到母本野生株A/Chicken/JN/Li-2/2010(H9N2)相應(yīng)的基因序列中。通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)獲得具有一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的病毒株。結(jié)果表明，與母本毒相比，PB2-E627K突變位點(diǎn)的出現(xiàn)使病毒在MDCK細(xì)胞和小鼠肺臟內(nèi)的復(fù)制能力均增強(qiáng)，且差異顯著(p＜0.0

7、5）;而只具有HA-313D/496S病毒株的復(fù)制能力與母本毒株相似。在致病力方面，以106EID50攻毒小鼠時(shí)，具有PB2-E627K的病毒對(duì)小鼠的致死性增強(qiáng)，其MLD50至少提高了316倍;而母本毒與只具有HA-313D/496S的病毒株并不對(duì)小鼠致死。106EID50攻毒小鼠后肺臟病理檢測(cè)結(jié)果表明，具有PB2-E627K病毒的小鼠肺臟病變集中在小血管和細(xì)支氣管周圍，伴有水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而母本毒與具有HA-313D/496S的病

8、毒株對(duì)應(yīng)的小鼠肺臟并無(wú)明顯的病理變化。聚合酶活性分析發(fā)現(xiàn)，具有PB2-E627K的毒株聚合酶活性至少提高了16倍，與母本毒相比差異顯著。病毒的酸、熱穩(wěn)定性未見(jiàn)明顯變化。以上結(jié)果說(shuō)明，PB2-E627K是鼠適應(yīng)株致病性增強(qiáng)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，并通過(guò)聚合酶活性的提高影響了病毒對(duì)宿主的致病性。
　　受體結(jié)合特性與致病性分析結(jié)果表明，H9N2亞型AIV具備了識(shí)別人類上呼吸道流感病毒受體的能力，并可通過(guò)單個(gè)氨基酸的突變獲得對(duì)哺乳動(dòng)物的高致病性