1、牡蠣是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水養(yǎng)殖品種，在世界很多地區(qū)都有養(yǎng)殖。而我國(guó)牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界首位。同時(shí)，牡蠣對(duì)銅、鋅等金屬具有很強(qiáng)的富集能力，經(jīng)常被用于指示河口污染情況。隨著工業(yè)發(fā)展，近岸河口區(qū)遭受越來(lái)越嚴(yán)重的金屬污染，銅就是其中非常有代表性的金屬污染物。因此牡蠣對(duì)銅的超富集現(xiàn)象越來(lái)越被人們所關(guān)注。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)牡蠣對(duì)銅富集存在非常大的個(gè)體差異，然而相關(guān)的研究卻非常有限，特別是缺少分子機(jī)制的解析。對(duì)這一現(xiàn)象的深入研究不但可以探尋、豐富牡蠣銅富集相

2、關(guān)機(jī)制，更可以為選育牡蠣不同金屬富集能力品系提供理論依據(jù)，有著非常重要的科研與生產(chǎn)價(jià)值。本研究選取我國(guó)南方牡蠣養(yǎng)殖的主要種類(lèi)福建牡蠣(Crassostrea angulata)作為研究對(duì)象，對(duì)其銅富集個(gè)體差異進(jìn)行分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)的研究，以轉(zhuǎn)錄組分析的方法尋找相關(guān)功能基岡并進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。并且進(jìn)一步研究了福建牡蠣銅富集個(gè)體差異是否可以遺傳給后代。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.福建牡蠣銅富集差異個(gè)體的轉(zhuǎn)錄分析
　　選取了兩

3、組存在銅富集差異(3-4倍)福建牡蠣的鰓和外套膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平分析，共發(fā)現(xiàn)372個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋和GO富集，它們集中在神經(jīng)遞質(zhì)載體蛋白基因、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)基因家族、多銅氧化酶基因以及一些脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)基因。而和銅毒性所引起的氧化損傷相關(guān)應(yīng)激基因并沒(méi)有差異表達(dá)。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)，牡蠣神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的差異表達(dá)，可以影響牡蠣神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控的生理行為，從而改變銅的富集動(dòng)力學(xué)過(guò)程，產(chǎn)生銅富集差異現(xiàn)象。和銅離子結(jié)合

4、、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，則使銅富集量高的牡蠣個(gè)體能夠保證細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)，免受銅的毒害。
　　2.神經(jīng)遞質(zhì)GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GAT2)在牡蠣銅富集中的作用
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果，選取神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT2基因作為潛在功能基因進(jìn)行研究。首先克隆獲得了GAT2基因cDNA片段。接著發(fā)現(xiàn)在該基因沉默后，牡蠣鰓和外套膜中銅富集量顯著降低，而在GABA受體拮抗劑注射后牡蠣銅富集量顯著升高，同時(shí)牡蠣濾水率和排氨率在GABA注射后呈現(xiàn)

5、劑量依賴(lài)性降低。這表明，神經(jīng)遞質(zhì)GABA可以調(diào)控牡蠣鰓和外套膜的生理行為，影響牡蠣對(duì)銅的富集，而神經(jīng)系統(tǒng)中GABA濃度則由其轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT2進(jìn)行調(diào)控。因此，GAT2基因的表達(dá)差異可能是引起牡蠣銅富集個(gè)體差異的關(guān)鍵因素。
　　3.多藥耐藥基因ABCB1在維持牡蠣銅解毒中的作用
　　克隆獲得福建牡蠣ABCB1基因cDNA全長(zhǎng)4544 bp，共編碼1370個(gè)氨基酸。其結(jié)構(gòu)中有典型的ABC家族保守結(jié)構(gòu)域，與其他雙殼類(lèi)有較高的同源性。福

6、建牡蠣ABCB1基因主要在鰓和外套膜的表皮柱狀細(xì)胞中表達(dá)，在銅脅迫下，表達(dá)量迅速升高，呈現(xiàn)時(shí)間與銅暴露劑量依賴(lài)性表達(dá)模式。在銅暴露第3d達(dá)到表達(dá)量高峰，最高濃度銅暴露組牡蠣鰓中表達(dá)量與對(duì)照組相比可達(dá)5.61倍(P＜0.01)。低濃度銅暴露組中隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，該基因表達(dá)量逐步恢復(fù)到和對(duì)照相近水平，但是在高濃度暴露組，其表達(dá)量依然顯著高于對(duì)照組。將ABCB1基因表達(dá)進(jìn)行抑制后發(fā)現(xiàn)，牡蠣鰓和外套膜中銅的富集水平呈現(xiàn)顯著增加。這些結(jié)果表明，

7、牡蠣ABCB1可以將銅作為一種底物進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，推測(cè)其在牡蠣維持細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)和銅解毒上發(fā)揮著重要作用。
　　4.漆酶(Laccase)在牡蠣銅累積中的作用
　　對(duì)漆酶在多種生物基因組中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)研究，發(fā)現(xiàn)牡蠣、扇貝的漆酶家族基因與人、昆蟲(chóng)、腹足類(lèi)以及其他海洋生物相比，在基因組中有明顯的擴(kuò)張現(xiàn)象?？寺～@得了福建牡蠣漆酶1類(lèi)似基因(Lac1-like) CDNA序列，全長(zhǎng)2760 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼蛋白含有796個(gè)氨基

8、酸，其中有漆酶家族保守銅離子結(jié)合位點(diǎn)。該基因在鰓室頂側(cè)表皮細(xì)胞與外套膜表皮柱狀細(xì)胞中表達(dá)量較高。在不同濃度銅暴露實(shí)驗(yàn)中，Lac1-like基因在鰓和外套膜中會(huì)被銅脅迫快速激動(dòng)，表達(dá)顯著上調(diào)，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸恢復(fù)到和對(duì)照組近似水平，呈現(xiàn)時(shí)間與銅暴露劑量依賴(lài)性變化。在對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行干擾后，發(fā)現(xiàn)牡蠣鰓和外套膜中銅的含量顯著降低，而鎘的富集水平與對(duì)照相比沒(méi)有顯著變化。以上結(jié)果表明，Lac1-like所結(jié)合的銅是牡蠣銅富集的重要組成部分

9、，漆酶家族在牡蠣中的擴(kuò)張與對(duì)銅的結(jié)合，也部分解釋了牡蠣為何擁有如此強(qiáng)的銅富集能力。
　　5.福建牡蠣銅富集能力遺傳性
　　通過(guò)測(cè)定，選擇銅富集有顯著差異的牡蠣親本組合產(chǎn)生家系。將后代家系在海上吊養(yǎng)8個(gè)月后進(jìn)行外套膜金屬含量以及整個(gè)軟體部銅、鋅、鎘含量測(cè)定。發(fā)現(xiàn)家系間存在顯著差異。而銅富集量高的親本組合產(chǎn)生的后代，銅、鋅富集量要高于低富集親本組合所產(chǎn)生的后代，銅的富集平均值在外套膜中甚至高出64.2％。同時(shí)，家系間以及個(gè)體間銅