1、利用動物乳腺生物反應器來生產(chǎn)藥用蛋白，是轉(zhuǎn)基因動物的主要應用之一。轉(zhuǎn)基因家畜乳腺生物反應器的研制周期較長，成本較高，因此在制作轉(zhuǎn)基因家畜之前，對乳腺表達載體表達性能的驗證是比較重要的。本試驗在乳腺上皮細胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中對我們實驗室構(gòu)建的人乳鐵蛋白基因乳腺表達載體(BLCl4)進行驗證，為制備轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應器奠定基礎。 1.BLCl4載體的組成：將山羊β-乳球蛋白基因調(diào)控序列，包括4.2kb的5'端和1.8 kb的3'端，

2、人乳鐵蛋白(hLF)cDNA，人巨細胞病毒(CMV)增強子序列及SV40 polyA序列和新霉素抗性篩選基因(Neor)等基因元件體外重組構(gòu)建成人乳鐵蛋白基因乳腺表達載體BLCl4。 2.乳腺上皮細胞的培養(yǎng)：采用膠原酶和透明質(zhì)酸酶共同消化法從健康的泌乳期山羊乳腺組織中分離到原代乳腺細胞；采用胰蛋白酶消化和反復貼壁法在DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3代，獲得純化的乳腺上皮細胞。通過電轉(zhuǎn)染法將表達載體BLCl4導入純化乳腺上皮細胞

3、中，經(jīng)G418篩選14d左右，獲得59株抗G418的單克隆細胞株，對擴大培養(yǎng)的抗性細胞株進行催乳素誘導，收集誘導后48h的細胞上清液進行ELISA檢測，結(jié)果顯示8株G418抗性細胞株能夠表達重組人乳鐵蛋白，克隆表達率為13.6％。 3.轉(zhuǎn)基因小鼠制備：將BLCl4構(gòu)件的質(zhì)粒用Sall與Notl限制性內(nèi)切酶消化，回收純化約10.6kb的基因片段。注射PMSG和hCGr使6—8周齡的C57♀超數(shù)排卵，與ICR♂進行交配后，獲得受精卵

4、1486枚，通過原核顯微注射法將表達載體片段注射到小鼠受精卵雄原核中，注射后存活卵數(shù)(移植數(shù))683枚，移植受體數(shù)26只，受體懷孕數(shù)10只，獲得仔鼠46只，經(jīng)過PCR檢測，有4只(1♀，3♂)為轉(zhuǎn)基因小鼠，整合率為8.69％。將轉(zhuǎn)基因小鼠分別與正常小鼠交配，得到的后代經(jīng)PCR檢測，25號(♂)轉(zhuǎn)基因小鼠的后代(F1代)中有6只為轉(zhuǎn)基因小鼠，整合率為37.5％(6/16)；而11號(♂)轉(zhuǎn)基因小鼠的后代(F1代)中未有基因整合小鼠。

5、 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白印跡法(Westem blot)對BLCl4原代轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達的重組人乳鐵蛋白進行檢測。ELISA檢測結(jié)果表明在BLCl4原代轉(zhuǎn)基因小鼠(19號)的乳汁中人乳鐵蛋白表達呈陽性，表達量約為1.5mg/mL。Westem blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中rhLF表達產(chǎn)物中有一個條帶與標準人乳鐵蛋白分子量相同，并且在20kDa大小的地方還有另外一個條帶。結(jié)果表明，本實驗室所構(gòu)建的BLCl4載體能