1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一種富含多種菌體蛋白的致病菌,其感染了世界人口的一半以上并與多種胃疾病密切相關(guān)。目前僅在苛刻的環(huán)境,如人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胃里發(fā)現(xiàn)H.pylori的存在。在胃或某些尚不清楚的傳播環(huán)境,H.pylori必須迅速耐受pH、氧化應(yīng)激及宿主免疫損傷才能得以生存。因此,了解H.pylori能夠在眾多惡劣環(huán)境中生存的調(diào)節(jié)機(jī)制是十分重要的。目前為止,直接探討H.pylori與環(huán)境因素

2、方面的研究較少。僅流行病學(xué)研究提示,高鹽飲食作為環(huán)境因素與H.pylori有著密切關(guān)系,高鹽飲食與H.pylori感染對(duì)胃疾病的發(fā)展有正協(xié)同作用。但尚未有明確證據(jù)表明,H.pylori是否能夠耐受高鹽環(huán)境。
　　 以往細(xì)菌學(xué)研究顯示,細(xì)菌能夠改變自身的生物學(xué)性狀及基因表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境的變化,這種改變對(duì)其生存極其重要。大多數(shù)致病菌可以通過(guò)基因表達(dá)改變,尤其是毒力基因表達(dá)改變來(lái)抵抗環(huán)境變化對(duì)其造成的影響,如環(huán)境因素可以調(diào)控產(chǎn)毒性大腸桿

3、菌(ETEC)毒力因子、定植因子表達(dá),高滲環(huán)境可以誘導(dǎo)S.typhimurium菌株侵襲基因invA的表達(dá);霍亂弧菌毒素、纖毛和其他毒力因子在高滲環(huán)境中仍然保持活性。John T.Loh和Hanan Gancz兩位學(xué)者分別用含有不同鹽濃度的液體培養(yǎng)液誘導(dǎo)H.pylori26695,以探索高鹽環(huán)境對(duì)H.pylori及其毒力因子表達(dá)有何影響,結(jié)果John T.Loh發(fā)現(xiàn)鹽導(dǎo)致了細(xì)菌cagA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)隨鹽濃度升高而增加,而Hanan

4、Gancz發(fā)現(xiàn)cagA轉(zhuǎn)錄水平未隨鹽濃度升高而增加,與John T.Loh結(jié)論不一致。H.pylori是否能夠在高鹽環(huán)境生存及其耐鹽機(jī)制如何?在高鹽環(huán)境下,H.pylori生物學(xué)特性有哪些改變及致病能力如何?均有待于進(jìn)一步研究。
　　 本文通過(guò)H.pylori的耐鹽性及其機(jī)制、高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)后其生物學(xué)特性差異及其致病能力的研究,探索H.pylori的特殊生存環(huán)境及其調(diào)節(jié)機(jī)制,為進(jìn)一步探討H.pylori傳播途徑及其臨床治療提供線索

5、。
　　 目的：
　　 探討H.pylori是否具有耐鹽性,其耐鹽機(jī)制如何;探討高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)后H.pylori生物學(xué)特性改變及其意義;探討高鹽誘導(dǎo)后H.pylori致病能力如何及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 利用不同鹽濃度培養(yǎng)條件(對(duì)照組、3％、15％、30％)培養(yǎng)來(lái)源于人胃黏膜的H.pylori,利用相關(guān)基因檢測(cè)和HE、吉姆薩染色、W-S銀染技術(shù)對(duì)H.pylori進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定;利用微生物活力檢測(cè)試劑盒

6、檢測(cè)經(jīng)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)后H.pylori活力情況;利用原子吸收分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Na+、K+的變化;利用碘結(jié)晶沉淀法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甜菜堿的變化。
　　 利用微生物活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的H.pylori活力變化情況;利用普通顯微鏡、電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)學(xué)變化;利用尿素酶實(shí)驗(yàn)觀察鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌酶學(xué)變化;利用Real-Time RT-PCR檢測(cè)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌ureB、cagA mRNA表達(dá)情況;利用western-blot技術(shù)檢

7、測(cè)鹽誘導(dǎo)培的細(xì)菌UreB、CagA蛋白表達(dá)情況;利用電鏡觀察細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)后H.pyIori在細(xì)胞周圍的定植情況。
　　 采用細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),利用普通光學(xué)顯微鏡及電鏡觀察細(xì)菌作用后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)損傷情況;利用免疫熒光檢測(cè)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌導(dǎo)致細(xì)胞DNA氧化損傷情況;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位改變情況;利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)菌導(dǎo)致細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki-67、PCNA、P21表達(dá)情況。

8、r>　　 結(jié)果：
　　 1、高鹽培養(yǎng)基收集的細(xì)菌,提取其DNA,經(jīng)16SrRNA、ureB、cagA基因擴(kuò)增并測(cè)序,聯(lián)合細(xì)菌特異性染色鑒定證實(shí)其為H.pylori。
　　 2、高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)菌的形態(tài)發(fā)生了改變,由螺旋桿狀向雙膜“U”、鏈鎖型、球體形轉(zhuǎn)變。
　　 3、高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)后H.pylori仍然具有尿素酶活力;仍然具有ATP活力;與對(duì)照組比,高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后細(xì)菌活力減低,30％鹽誘導(dǎo)組細(xì)菌活力強(qiáng)于3％

9、、15％鹽組;
　　 4、H.pylori耐鹽與細(xì)胞內(nèi)K+、甜菜堿蓄積密切相關(guān)。
　　 5、不同鹽濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)的H.pylori cagA mRNA及蛋白表達(dá)下降,但無(wú)濃度依賴性,15％鹽組下降幅度高于30％鹽組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的H.pylori ureB mRNA轉(zhuǎn)錄水平30％鹽組高于15％鹽組,UreB蛋白表達(dá)下降,15％鹽組高于30％鹽組,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、電鏡觀察高鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)

10、的H.pylori仍可在細(xì)胞周圍定植。
　　 7、30％鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的H.pylori可以導(dǎo)致GES-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷;可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA氧化損傷,8-OhDG表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;可以導(dǎo)致線粒體膜的破壞,線粒體膜電位下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 8、30％鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)的H.pylori可導(dǎo)致反映細(xì)胞增殖改變的生物標(biāo)志Ki-67、PCNA表達(dá)增高,P21表達(dá)下降,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：