1、目的:胃癌發(fā)病因素很多，本課題通過調(diào)查胃癌病人血清中抗幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(Cytotoxin associated gene A，CagA)抗體的產(chǎn)生情況，檢測胃癌組織中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer1，MACC1)的表達(dá)，同時分析胃癌患者IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)Th17細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17A、IL-23、I

2、L-1β、IFN-γ)及其轉(zhuǎn)錄因子(RORγt、T-bet)的表達(dá)水平，探討:胃癌病人血清中抗CagA抗體的產(chǎn)生和分布情況;MACC1與胃癌的關(guān)系及臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與胃癌的關(guān)系及臨床病理參數(shù)的關(guān)系;并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法:1)所有胃癌患者與健康人群對照組外周血標(biāo)本或手術(shù)標(biāo)本均來自蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，所有胃癌患者均記錄性別、年齡及術(shù)后臨床病理分期資料;<

3、br>　　2)通過構(gòu)建幽門螺桿菌CagA蛋白的原核表達(dá)載體，獲得CagA蛋白，通過ELISA方法檢測胃癌患者血清中抗CagA抗體的產(chǎn)生情況;
　　3)采用RT-PCR檢測胃癌患者癌組織和癌旁組織中MACC1 mRNA的表達(dá)情況，同時利用免疫組化技術(shù)分析MACC1在胃癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;
　　4)分離健康人群對照組和胃癌患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)(1×106/cells)，應(yīng)用PMA(50

4、ng/ml)+Ionomycin(1μg/ml)+Monensin(500ng/ml)刺激培養(yǎng)5h，采用多色流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse flow cytometer)分別檢測IL-17A+/IFN-γ+CD3+T(CD4、CD8、γδT)細(xì)胞頻數(shù);
　　5)采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)技術(shù)，檢測外周血PBMC中IL-17A+T細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子RORγt，IFN-γ+T細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet及IL-

5、17A+/IFN-γ+T細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ mRNA的表達(dá)水平;
　　6)采用液相芯片技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測胃癌患者和健康人群對照組血清IL-17A、IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度;
　　7)采用SPSS19.0軟件對胃癌組織與癌旁組織MACC1 mRNA表達(dá)水平，IL-17A+/IFN-γ+CD3+T細(xì)胞的頻數(shù)及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平、胃癌患者臨床

6、病理分期等資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:1)表達(dá)制備高純度的CagA融合蛋白，利用間接ELISA法，調(diào)查發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中CagA抗體的陽性率高達(dá)83.3％，且與患者的年齡、性別和腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理分期等無顯著性差異，同時發(fā)現(xiàn)正常健康體檢者的CagA抗體陽性率僅為5％。
　　2)MACC1 mRNA在胃癌組織中陽性率為70％，顯著高于癌旁組織，MACC1 mRNA表達(dá)與胃癌浸潤深度、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

7、、TNM分期呈正相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)。并且免疫組化實驗結(jié)果表明，MACC1蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中基本不表達(dá)。
　　3)與健康人群對照組比較，胃癌患者組外周血中Th17、γδT17細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的頻數(shù)顯著升高，Tc17細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞中的頻數(shù)顯著降低，且Th17細(xì)胞頻數(shù)與Tc17細(xì)胞頻數(shù)呈負(fù)相關(guān);IFN-γ+CD3+CD4+Th1細(xì)胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞及IFN-γ+CD3+

8、γδT細(xì)胞在胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中的比例均顯著低于健康體檢組;
　　4)在外周血Th17、Tc17、IFN-γ+CD3+CD4+T、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞的比例與腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)、腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M0/M1)分別存在顯著差異;Tc17、γδT17、IFN-γ+CD3+CD8+T及IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞在TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)中均存在顯著差異;γδT17、IFN-γ+CD3+

9、γδT細(xì)胞與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0/N1+N2+N3)存在顯著差異;
　　5)細(xì)胞內(nèi)IL-17A因子在外周血CD3+T細(xì)胞中的來源主要為Th17細(xì)胞，其次為Tc17細(xì)胞，而γδT17細(xì)胞所占比例最少;而細(xì)胞內(nèi)IFN-γ+因子在外周血CD3+T細(xì)胞中的來源主要為CD8+T細(xì)胞，其次為CD4+Th1細(xì)胞，而γδT細(xì)胞所占比例最少;
　　6)胃癌患者血清IL-17A、IL-23、IL-1β的濃度顯著高于健康人群對照組，而IFN-γ

10、的濃度顯著低于健康人群對照組;且IL-17A、IL-23、IL-1β及IFN-γ在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0/N1+N2+N3)和TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)中均存在顯著差異;IL-23、IL-1β、IFN-γ濃度在腫瘤的浸潤深度(T1+T2/T3+T4)中分別存在顯著差異;IL-1β濃度在腫瘤的分化程度（高-中分化/低分化）也存在一定的差異;此外在胃癌患者中血清IL-17A的濃度與Th17細(xì)胞的頻數(shù)密切相關(guān)(r=0.3310，p=0.02

11、31);
　　7)IL-17A+CD3+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的RORγt mRNA在胃癌患者中的表達(dá)水平顯著高于健康人群對照組;而IFN-γ+CD3+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA表達(dá)水平顯著低于健康人群對照組(P＜0.05);
　　結(jié)論: 1)我國胃癌患者大多數(shù)與感染CagA陽性的幽門螺桿菌有關(guān)，血清中CagA抗體的檢測有望成為胃癌高危因素的參考指標(biāo);
　　2) MACC1表達(dá)與胃癌的浸潤深度、分化程度及有無淋

12、巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM分期呈正相關(guān)，有望成為胃癌診療的一個新指標(biāo);
　　3)胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中，Th17和γδT17細(xì)胞呈高表達(dá)，Tc17細(xì)胞呈低表達(dá)，且細(xì)胞內(nèi)IL-17A的來源主要為Th17細(xì)胞，這些IL-17A+CD3+T細(xì)胞與腫瘤的病理特征存在相關(guān)性;
　　4)胃癌患者外周血CD3+T細(xì)胞中，IFN-γ+CD3+CD4+Th1細(xì)胞、IFN-γ+CD3+CD8+T細(xì)胞及IFN-γ+CD3+γδT細(xì)胞呈低表達(dá)，且細(xì)胞內(nèi)