1、目的：建立核內(nèi)穩(wěn)定表達巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）的細胞系，驗證核內(nèi)M-CSF與微小染色體維持蛋白7（Mcm7）的分子間相互作用，初步探討M-CSF-Mcm7相互作用對細胞DNA復(fù)制的影響。 方法：將M-CSF核定位重組表達載體pCMV/nuc/M-CSF、空載體pCMV/nuc/myc及陽性對照載體pCMV/nuc/GFP分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，經(jīng)G418篩選并擴增陽性克隆后，用RT-PCR、Western blot和免疫

2、熒光染色證實陽性克隆有否表達M-CSF及其定位；免疫共沉淀法驗證核內(nèi)M-CSF與其靶分子Mcm7的相互作用，BrdU標記法分析M-CSF與Mcm7分子間相互作用對細胞內(nèi)DNA復(fù)制的影響，構(gòu)建無細胞體外復(fù)制分析體系研究M-CSF與Mcm7結(jié)合作用于DNA復(fù)制的起始還是延伸階段。 結(jié)果：RT-PCR、Western blot 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pCMV/nuc/M-CSF的HeLa細胞能穩(wěn)定表達M-CSF mRNA和蛋白，免疫熒光染色示M

3、-CSF的表達定位于細胞核；抗Mcm7單克隆抗體能沉淀轉(zhuǎn)染pCMV/nuc/M-CSF的HeLa細胞中的M-CSF，提示：M-CSF與Mcm7直接結(jié)合；BrdU標記法顯示：M-CSF與Mcm7的相互作用可促進DNA的復(fù)制；表達M-CSF的細胞核不論處于G1期還是S期，其復(fù)制能力均比對照組強，提示DNA復(fù)制的起始和延伸都受M-CSF與Mcm7相互作用的調(diào)節(jié)。 結(jié)論：成功建立了一個核內(nèi)穩(wěn)定表達M-CSF的HeLa細胞系； M-CSF