1、目的:本研究擬通過(guò)建立甲基化敏感性高分辨率溶解曲線法(MS-HRM)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF受體KDR基因啟動(dòng)子區(qū)域在不同時(shí)期血管瘤、血管畸形及正常皮膚組織等中的甲基化狀態(tài),初步探討基因甲基化在血管瘤形成、增生、退化過(guò)程中的作用。
　　 方法:選取不同時(shí)期血管瘤石蠟標(biāo)本48例、血管畸形石蠟標(biāo)本15例、正常包皮皮膚組織標(biāo)本8例,分別提取DNA,經(jīng)亞硫酸氫鹽甲基化修飾、純化、回收DNA,以QIAGEN公司的全基因組甲基化DNA作

2、為100％甲基化標(biāo)準(zhǔn)品,與100％非甲基化健康孕婦臍帶血DNA按比例混合,稀釋制成0％、5％、25％、50％、75％、100％系列濃度甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品,將甲基化標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行MS-HRM溶解曲線檢測(cè)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行重復(fù)性和靈敏度評(píng)價(jià)。然后用甲基化敏感性高分辨率溶解曲線法(MS—HRM)定量檢測(cè)增生期血管瘤24例、消退期血管瘤24例,血管畸形15例,正常包皮皮膚組織8例等標(biāo)本中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR甲基化水平。

3、>　　 結(jié)果:成功制成的100％、75％、50％、25％、5％、0％甲基化標(biāo)準(zhǔn)曲線依次從右往左排列,經(jīng)過(guò)三次重復(fù)檢測(cè),曲線基本重疊一致；經(jīng)過(guò)MS-HRM檢測(cè),48例血管瘤標(biāo)本共檢出32例不同程度KDR基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化(66.67％),其中24例增殖期血管瘤標(biāo)本中檢出21例(21／24,87.50％)不同程度甲基化,1例甲基化程度為0％～5％,11例甲基化為25％～50％,5例甲基化為75％,4例甲基化為100％；24例消退期血管瘤

4、標(biāo)本中檢出11例(11／24,45.83％)不同程度甲基化,其中,1例甲基化程度為75％,8例甲基化為25％～50％,2例甲基化為0％～5％,增殖期血管瘤與消退期血管瘤標(biāo)本中KDR的甲基化程度比較差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.375,P<0.05)；15例血管畸形標(biāo)本中僅檢出甲基化程度為0％～25％2例(2／15,13.33％),8例正常包皮皮膚組織中檢測(cè)到1例甲基化0％～5％(1／8,12.50％)。與血管瘤相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)

5、學(xué)意義(P<0.05,Fisher'確切概率法)；消退期血管瘤與血管畸形中KDR的甲基化程度比較有顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.45,Fisher'確切概率法)。
　　 結(jié)論:①血管瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR基因啟動(dòng)子序列CpG島存在異常甲基化,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR基因異常甲基化可能與血管瘤增生、退化等有關(guān)；②MS—HRM技術(shù)定量檢測(cè)血管瘤中KDR甲基化程度的方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,成本低,可重復(fù)性強(qiáng),為進(jìn)一步研究