1、魚藤酮是一種應(yīng)用廣泛的農(nóng)業(yè)殺蟲劑，能選擇性地結(jié)合并抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，從而破壞細(xì)胞呼吸鏈的正常功能。流行病學(xué)資料顯示，長(zhǎng)期低劑量接觸魚藤酮的人群帕金森病的發(fā)病機(jī)率高于未暴露人群。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，魚藤酮能作用于黑質(zhì)一紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，使之發(fā)生凋亡。海馬組織的膽堿能神經(jīng)元與黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元間聯(lián)系密切，而MAPIGERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在學(xué)習(xí)記憶的形成鞏固及神經(jīng)元凋亡的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著一定的作用。因此，研究魚藤酮對(duì)海馬MAPK/

2、ERK級(jí)聯(lián)的調(diào)控機(jī)制以及活化后的ERK1/2在神經(jīng)元凋亡中的具體作用，對(duì)于我們從新的角度了解環(huán)境因素在神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)理以及魚藤酮致細(xì)胞凋亡的具體作用途徑提供相關(guān)的理論依據(jù)。 目的：通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明魚藤酮對(duì)大鼠海馬MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的上游調(diào)控機(jī)制，初步判斷MAPK/ERK級(jí)聯(lián)在魚藤酮致海馬神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)理，了解環(huán)境毒物的具體作用靶點(diǎn)，從而為神經(jīng)退變性疾病的研究提供理論依據(jù)。 方法：(1)建立大鼠

3、魚藤酮染毒模型，觀察大鼠一般情況變化，HE染色檢測(cè)心、肝、脾、腎的改變，以了解魚藤酮對(duì)動(dòng)物的一般損傷情況。(2)采用HE染色、FJB復(fù)合尼氏熒光染色、[ca<'2+>]<,i>檢測(cè)、免疫組化、Western蛋白印跡法等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察魚藤酮作用對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響以及ERK1/2活化情況，檢測(cè)ERK1/2主要上游調(diào)控蛋白因子表達(dá)情況。(3)建立原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元魚藤酮染毒模型，倒置顯微鏡觀察魚藤酮體外作用對(duì)神經(jīng)元的影響；MT

4、T法檢測(cè)細(xì)胞活性改變；Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡情況；激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>變化；通過(guò)加入MEK抑制劑PD98059、L型Ca<'2+>通道阻斷劑Nimodipine、PKA抑制劑KT5720、PKC抑制劑Chelerythrine以及raf-1蛋白激活阻斷劑Sulindac Sulfide預(yù)處理細(xì)胞與單純?nèi)径颈容^，免疫組化觀察磷酸化ERK1/2的變化情況。 結(jié)果：(1)成

5、功建立了微量滲透泵植埋魚藤酮大鼠染毒模型，大鼠出現(xiàn)類似帕金森病的癥狀。HE染色顯示中毒組大鼠心、肝、脾、腎出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)改變，其中以肝腎改變最為顯著。(2)FJB復(fù)合尼氏熒光染色顯示染毒組大鼠海馬內(nèi)出現(xiàn)退變神經(jīng)元，免疫組化及Western蛋白印跡法提示染毒組大鼠海馬內(nèi)磷酸化ERK1/2和Ras蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較有所增高，染毒組大鼠海馬神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>升高明顯，而PKC和PKA激酶的活性也有一定程度的升高。(3)

6、成功建立體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元魚藤酮染毒模型，鏡下觀察隨著魚藤酮染毒濃度升高、時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的形態(tài)學(xué)變化。主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、折光性增強(qiáng)甚至細(xì)胞漂浮。MTT法進(jìn)一步證實(shí)魚藤酮隨著染毒濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性呈下降趨勢(shì)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示魚藤酮體外作用可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PD98059預(yù)處理復(fù)合染毒與單純?nèi)径颈容^凋亡率在染毒8h時(shí)有顯著升高。不同劑量、不同時(shí)間魚藤酮染毒處理后神經(jīng)元[ca<'2+>]<,i>與對(duì)照組比較均有

7、所升高，且Nimodipine預(yù)處理可以在特定的時(shí)間里阻斷[Ca<'2+>]<,i>的升高。不同阻斷抑制劑預(yù)處理后與單純?nèi)径颈容^發(fā)現(xiàn)，PD98059和Sulindac Sulfide可以下調(diào)磷酸化ERK1/2的表達(dá)水平，而Nimodipine，KT5720和Chelerythrine預(yù)處理沒有顯著改變。 結(jié)論：(1)魚藤酮對(duì)大鼠全身毒性作用顯著，對(duì)肝、腎損傷作用明顯。(2)魚藤酮體內(nèi)、外作用均可以誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡。魚藤

8、酮可以激活大鼠海馬MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路導(dǎo)致ERK1/2磷酸化水平升高，活化的ERK1/2可能參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展，并在其中起到保護(hù)作用。 (3)魚藤酮染毒條件下Ca<'2+>在海馬神經(jīng)元胞體內(nèi)的升高早期主要不是通過(guò)L-型Ca<'2+>通道的作用，L-型Ca<'2+>通道主要在魚藤酮染毒中期發(fā)揮作用，是中期胞內(nèi)Ca<'2+>升高的主要途徑。低劑量魚藤酮刺激即會(huì)引起[Ca<'2+>]<,i>顯著升高，但其升高有一定限度，不呈時(shí)間