1、研究背景:心血管疾病關乎人類健康與生活質(zhì)量，急性心肌梗死是常見的心血管疾病，其發(fā)病率與致死率逐年上升。如何找到預防與治療急性心肌梗死損傷的藥物作用靶點及開發(fā)治療心肌梗死的相關藥物成為國內(nèi)外研究的熱點。該疾病的中樞發(fā)病機制與治療策略的研究主要集中于中樞心血管調(diào)節(jié)區(qū)，如下丘腦室旁核(hypothalamic paraventricular nuclei，PVN)與延髓頭端腹外側區(qū)(rostralventrolateral medulla,

2、RVLM)，其主要通過炎癥、氧化應激等相關信號通路對急性心肌梗死損傷起調(diào)控作用，調(diào)節(jié)機制錯綜復雜，尚存諸多未解之謎。新近的研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體能夠促進炎癥反應、致炎細胞因子合成與釋放，那么中樞PVN內(nèi)炎癥反應是否參與對急性心肌梗死的調(diào)控呢？如果參與，是否與P2X7受體有關呢？如果有關，P2X7受體又是如何調(diào)控炎癥細胞因子產(chǎn)生的呢？P2X7受體是通過何種途徑參與炎癥因子的產(chǎn)生并影響外周交感神經(jīng)活動進而發(fā)揮其對心肌梗死損傷調(diào)控作用的呢？目

3、前，所有有關中樞PVN區(qū)P2X7受體調(diào)節(jié)心血管活動的分子機制仍不清楚。
　　目的:本課題以大鼠急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）損傷模型為研究對象，研究下丘腦室旁核小膠質(zhì)細胞P2X7受體通過影響外周交感神經(jīng)活動進而調(diào)節(jié)大鼠急性心肌梗死損傷。從形態(tài)學與分子生物學角度，觀察AMI組與Sham組大鼠下丘腦室旁核P2X7受體蛋白的表達。從功能學角度，觀察AMI組與AMI+si-P2X7組大鼠外周

4、交感神經(jīng)活動與心功能的改變，來證實中樞PVN通過P2X7受體參與對大鼠AMI損傷的調(diào)節(jié)。再者，從形態(tài)學與分子生物學角度，觀察AMI組與AMI+si-P2X7組中樞PVN區(qū)催產(chǎn)素(Oxytocin，OT)與血管升壓素(Vasopressin，AP)的表達，進一步判斷P2X7受體通過腦內(nèi)哪類神經(jīng)元參與對大鼠AMI的調(diào)控？最后，從分子生物學與形態(tài)學角度，觀察中樞PVN內(nèi)促炎細胞因子(interleukin1β，IL-1β和tumor necr

5、osis factor-α，TNF-α)表達及促炎細胞因子上游調(diào)控蛋白caspase-1與P65-NF-κB的表達，更深一步研究P2X7受體通過相關分子信號轉導通路調(diào)控大鼠急性心肌梗死損傷。
　　方法:采用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備大鼠AMI模型，并同時監(jiān)測大鼠平均動脈壓(MAP)，心率(HR)，心室內(nèi)壓(IVP)與左室舒張末期壓(LVEDP)。采用氯化四唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid

6、e，TTC）染色檢測大鼠急性心肌梗死造模是否成功，蘇木精和伊紅(HE)染色觀察不同心肌缺血時間點心肌組織病理學改變。采用激光共聚焦結合免疫熒光雙標技術，觀察中樞PVN內(nèi)小膠質(zhì)細胞標志蛋白Iba-1與P2X7受體蛋白共表達情況;采用蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測各組大鼠（Sham組、AMI組、AMI組+si-RNA組、AMI組+BBG組）PVN內(nèi)P2X7、IL-1β與TNF-α蛋白表達的變化;同時應用酶聯(lián)免疫吸附測定法(EL

7、ISA)測定各組大鼠PVN核團組織中IL-1β與TNF-α的含量:與此同時，通過生物信息采集系統(tǒng)觀察各實驗組大鼠心肌缺血后血流動力學、外周交感神經(jīng)活動及心臟自主神經(jīng)變化，并應用心率變異性(HRV)分析系統(tǒng)分析大鼠心臟自主神經(jīng)功能狀態(tài)。采用免疫組織化學(IHC)方法檢測AMI組與AMI+siRNA組大鼠PVN內(nèi)催產(chǎn)素與血管升壓素的表達，明確P2X7受體經(jīng)釋放炎癥因子激活或敏化中樞內(nèi)哪類神經(jīng)元;采用免疫組織化學(IHC)方法檢測AMI組與A

8、MI+siRNA組大鼠PVN內(nèi)炎癥細胞因子上游調(diào)控蛋白Caspase-1與P65-NF-κB的表達。
　　結果:
　　(1)大鼠AMI模型的制備:結扎大鼠冠狀動脈左前降支，大鼠立即出現(xiàn)心電圖S-T段抬高，結扎線遠端心肌發(fā)白，收縮力降低，運動減弱。TTC染色顯示:心肌缺血區(qū)域發(fā)白;HE染色結果顯示:隨著缺血時間的延長，心肌梗死程度越嚴重并伴有心肌纖維溢出;這些結果證實了大鼠AMI模型制備成功。
　　(2)激光共聚焦免疫熒

9、光雙標結果顯示:P2X7受體蛋白在大鼠PVN區(qū)與小膠質(zhì)細胞標志性蛋白Iba-1有共表達，且主要集中于PVN區(qū)域，80％集中表達在小膠質(zhì)細胞胞膜、胞質(zhì)而在胞核內(nèi)無表達。
　　(3)生物發(fā)光測定結果顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)ATP釋放量迅速增加(P＜0.05，n=6)且呈時間依賴關系;在心肌缺血4 h時間點ATP的釋放量達最高點，心肌缺血8h后ATP含量逐漸降低。
　　(4) RT-PCR和Western

10、 blot結果顯示:P2X7R蛋白在各組大鼠PVN中均有表達，與Sham組相比，AMI組表達量明顯升高(P＜0.05，n=6)且呈時間依賴關系，心肌缺血后4h達最高峰;與AMI組相比，AMI+P2X7R-siRNA組與AMI+BBG組大鼠PVN內(nèi)P2X7R、IL-1β與TNF-α蛋白與mRNA表達量均明顯下降(P＜0.05，n=6)。
　　(5) ELISA檢測方法顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN內(nèi)IL-1β與TNF-α濃

11、度增高(P＜0.05，n=6);事先PVN內(nèi)給予P2X7R-siRNA或腹腔給予BBG能明顯降低IL-1β與TNF-α濃度(P＜0.05，n=6)。
　　(6)免疫組織化學結果顯示:與Sham組相比，AMI大鼠PVN區(qū)OT能陽性神經(jīng)元與VP能陽性神經(jīng)元數(shù)目增多(P＜0.05，n=6)，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后OT與VP能免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目與AMI組相比明顯降低(P＜0.05，n=6)。與Sham組相比，AMI大鼠P

12、VN區(qū)Caspase-1與P65-NF-κB表達量增多(P＜0.05，n=6);與AMI組相比，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后Caspase-1表達量明顯減少(P＜0.05，n=6);然而，PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA后P65-NF-κB表達量與AMI組相比，無明顯變化(P＞0.05，n=6)。
　　(7)血流動力學與心肌力學檢測結果顯示:與AMI組大鼠相比，預先PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預

13、先給予P2X7受體阻斷劑BBG能使AMI大鼠(AMI+siRNA組、AMI+BBG組)MAP、HR、IVP、LVEDP與HRV(LF/HF)各項指標均降低(P＜0.05，n=6)。
　　(8)外周腎交感神經(jīng)活動(RSNA)記錄結果顯示:與Sham組大鼠相比，AMI組大鼠RSNA增強(P＜0.05，n=6);預先PVN內(nèi)微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預先給予BBG能使AMI組大鼠RSNA減弱(P＜0.05，n=6)。

14、　　結論:
　　(1)結扎大鼠冠狀動脈左前降支制備急性心肌梗死模型，致使外周交感神經(jīng)活動增強，同時致AMI大鼠下丘腦PVN內(nèi)P2X7受體蛋白高表達，可能與心傳入反射有關;與此同時，高表達的P2X7受體增強外周交感神經(jīng)活動，進一步加劇急性心肌梗死損傷。如此的反饋機制形成一個惡性循環(huán)過程，促使大鼠AMI損傷進一步惡化。
　　(2) PVN內(nèi)預先微量注射P2X7R-siRNA或腹腔內(nèi)預先給予BBG，可以降低PVN內(nèi)IL-1β與TN