1、目的：觀察鞘內(nèi)注射甲氨蝶呤對脛骨癌痛大鼠機械痛敏的影響，并觀察其對脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)分泌的影響，初步探討其可能的脊髓機制。
　　方法：實驗分兩部分完成，第一部分實驗：將48只雌性SD大鼠隨機均分為6組(n=8)：假手術(shù)+人工腦脊液組(SA組)，假手術(shù)+甲氨蝶呤200μg組(SM組)骨癌痛+人工腦脊液組(CA組)，骨癌痛+甲氨蝶呤50μg組(CM50組

2、)，骨癌痛+甲氨蝶呤100μg組(CM100組)，骨癌痛+甲氨蝶呤200μg組(CM200組)。模型組脛骨骨髓腔內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞，假手術(shù)組脛骨骨髓腔內(nèi)注射等體積生理鹽水，各組于造模前，造模后1、3、5、7d測定機械性縮足閾值(MWT)，第7天測定MWT后鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量甲氨蝶呤或等體積人工腦脊液，并于給藥后2、4、8、24h與給藥后2、3、5、7d測定MWT，最后處死大鼠留取手術(shù)側(cè)脛骨，HE染色觀察脛骨內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長情

3、況。第二部分實驗：將30只雌性SD大鼠隨機均分為3組(n=10)：假手術(shù)+人工腦脊液組(SA11組)，骨癌痛+人工腦脊液組(CA11組)，骨癌痛+甲氨蝶呤100μg組(CM11組)。各組于造模前，造模后1、3、5、7d測定機械性縮足閾值(MWT)，第7天測定MWT后鞘內(nèi)注射甲氨蝶呤100μg或等體積人工腦脊液，并于給藥后2、4、8、24h測定MWT；隨后分別行灌注取材和新鮮取材，免疫熒光觀察脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，Elisa檢測脊髓T

4、NF-α和IL-1β含量的變化。
　　結(jié)果：(1)機械痛行為學(xué)：脛骨骨髓腔內(nèi)注射同源乳腺癌細(xì)胞后大鼠MWT逐漸降低，至造模后7d時較術(shù)前明顯減低(P<0.05)；鞘內(nèi)注射甲氨蝶呤后MWT逐漸增加，其中CM100組與CM200組在給藥后4h較給藥前增加(P<0.05)，至24h時達(dá)最大效應(yīng)(P<0.05)，持續(xù)至給藥后5d時恢復(fù)到給藥前水平(P>0.05)，但仍高于CA組(P<0.05)。(2)脛骨組織學(xué)：CA組與CM200組組織學(xué)

5、檢測發(fā)現(xiàn)脛骨髓腔內(nèi)充滿了腫瘤細(xì)胞，骨結(jié)構(gòu)改變明顯，而SA組未見骨結(jié)構(gòu)改變。(3)免疫熒光染色：CA11組Iba-1染色的小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎遍布整個脊髓背角灰質(zhì)，胞體肥大，染色加深，小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)顯示CA11組較SA11組明顯增加(P<0.05)，而鞘內(nèi)注射甲氨蝶呤后CM11組脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞計數(shù)較CA11組明顯減少(P<0.05)。(4)Elisa：脊髓TNF-α和IL-1β的表達(dá)量在CA11組顯著增高(與SA11組比較，(P<0.05)