1、半胱氨酸蛋白酶是生物體內(nèi)蛋白水解的主要參與者，參與了生物體的細胞凋亡、組織降解、免疫防御等過程。家蠶半胱氨酸蛋白酶抑制劑(BmCPI)作為家蠶半胱氨酸蛋白酶(BCP)的專性抑制劑在機體調(diào)控方面發(fā)揮了重要的作用，昆蟲在其變態(tài)發(fā)育中都有半胱氨酸蛋白酶及其抑制劑的參與。
　　半胱氨酸蛋白酶抑制劑廣泛地分布于動物，植物以及微生物當(dāng)中，它可以占據(jù)半胱氨酸蛋白酶活性中心，形成緊密的復(fù)合物，以此抑制半胱氨酸蛋白酶的活性。昆蟲中對半胱氨酸蛋白酶抑

2、制劑的研究較少，本研究主要通過基因克隆，原核表達，Western Blot，免疫組化，雙熒光素酶報告系統(tǒng)，定點突變，進化分析等方法對家蠶體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(BmCPI)進行鑒定，并對其在家蠶體內(nèi)的分布及表達調(diào)控方式進行探究，為深入研究半胱氨酸蛋白酶抑制劑在家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用提供數(shù)據(jù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1、家蠶半胱氨酸蛋白酶抑制劑克隆、表達、純化及抗體制備
　　利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫以及NCBI對家蠶體內(nèi)的

3、半胱氨酸蛋白酶抑制劑進行比對，發(fā)現(xiàn)家蠶中兩個編碼I29抑制劑家族的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的基因，分別命名為BmCPI39和BmCPI40，其中BmCPI39編碼105個氨基酸，成熟體大小約為11.16 KD，等電點約為6.09; BmCPI40編碼121個氨基酸，成熟大小約為13KD，等電點約為4.39，兩者成熟體都不含半胱氨酸，無二硫鍵。親緣關(guān)系上BmCPI39和BmCPI40和家蠶NPV病毒體內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶較近。
　　對Bm

4、CPI39和BmCPI40基因序列進行克隆、表達，同時得到BmCPI39和BmCPI40的可溶性蛋白，進一步對其進行純化，得到的高純度蛋白制備多克隆抗體。效價檢測顯示BmCPI39和BmCPI40的抗體效價均高于1∶512，000，濃度分別為1.62 mg/ml和1.25 mg/ml，進一步的抗體特異性檢測顯示BmCPI39和BmCPI40的多克隆抗體均可與抗原特異性結(jié)合，制備的抗體可用于后續(xù)實驗。
　　2、重組家蠶半胱氨酸蛋白酶

5、抑制劑的活性測定及關(guān)鍵氨基酸檢測
　　對重組BmCPI39和BmCPI40活性測定結(jié)果顯示，重組的BmCPI39和BmCPI40能夠有效的抑制組織蛋白酶L的活性。圓二色譜(CD)掃描結(jié)果顯示，重組的BmCPI39和BmCPI40具有極高的熱回復(fù)性。對BmCPI39和BmCPI40所編碼的蛋白質(zhì)進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及定點突變，發(fā)現(xiàn)BmCPI39第45位的精氨酸在維持其完整的三維結(jié)構(gòu)上起到重要的作用。
　　3、家蠶半胱氨酸蛋白酶抑制

6、劑的表達特征及組織定位
　　核酸水平上檢測家蠶5齡第3天各組織以及各時期BmCPI39和BmCPI40的表達情況，RT-PCR及Q-PCR顯示， BmCPI39主要在血淋巴中表達，BmCPI40在體壁中表達量較高。Q-PCR檢測時期表達顯示，BmCPI39在眠期及變態(tài)期表達量上升，且蛹期表達量高于幼蟲期，BmCPI40基本呈相反表達模式，在眠期及變態(tài)期BmCPI40表達量下調(diào)，幼蟲期表達量高于蛹期。家蠶5齡第3天及各時期蛋白水平的

7、Western Blot檢測結(jié)果基本與核酸水平檢測結(jié)果相一致。免疫熒光的結(jié)果顯示BmCPI40主要存在于家蠶體壁的表皮層及皮細胞層，由皮細胞向外周分泌。
　　4、家蠶半胱氨酸蛋白酶抑制劑表達調(diào)控初探
　　20E誘導(dǎo)家蠶后發(fā)現(xiàn)，血淋巴中BmCPI39的表達量明顯上升，體壁中BmCPI40的表達量則降低，證實BmCPI39及BmCPI40都受到蛻皮激素的調(diào)控。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測家蠶BmE細胞中BmCPI39啟動子和BmCPI