1、血腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)通透性增加在感染性腦損傷的發(fā)病中起關(guān)鍵作用。BBB主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)及緊密連接(tight junction,TJ)構(gòu)成,BBB發(fā)揮著物理和代謝屏障的功能,保護(hù)脆弱的腦組織免受毒物、炎癥因子的攻擊,提供營養(yǎng)物質(zhì)、過濾有害物質(zhì),降低腦組織對微環(huán)境改變的易感性,從而保證腦功能的正常發(fā)揮。而B

2、MECs及緊密連接通透性變化是導(dǎo)致BBB屏障功能破壞的主要原因之一。
　　腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種多功能的炎癥前細(xì)胞因子,我們前期的研究發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌性腦膜炎動物模型中TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)量在造模240 min達(dá)高峰,并與BBB通透性增高成正比;同樣利用TNF-α刺激體外BBB模型5 hr后,BBB通透性明顯增高,應(yīng)用Rho激酶抑制劑Y-27632可以明顯抑制TN

3、F-α引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高。提示TNF-α可能通過RhoA參與了感染性腦損傷導(dǎo)致的BBB破壞的病理過程,但其具體的調(diào)控方式及上游的調(diào)控機(jī)制不明。因此研究TNF-α對RhoA活化的影響及其具體的調(diào)控機(jī)制,有助于了解TNF-α引起B(yǎng)BB通透性增高的病理過程。對這一問題的深入探討,有助于進(jìn)一步闡明感染性腦水腫腦損傷的發(fā)病機(jī)制,為其臨床防治提供新的思路。本研究分為三部分:
　　第一部分RhoA參與TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通

4、透性增高的調(diào)控研究
　　目的：證實(shí)RhoA參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的BMECs通透性增高。
　　方法：體外培養(yǎng)小鼠BMECs(Bend.3細(xì)胞株),分別將PcDNA3.1hygro-n19RhoA(RhoA的負(fù)性質(zhì)粒)和PcDNA3.1hygro-vector(空載對照質(zhì)粒)導(dǎo)入Bend.3細(xì)胞,利用潮霉素B篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。Western blot鑒定RhoA蛋白的表達(dá)抑制情況;pull-down檢測TNF-α作用不同時(shí)間后

5、,BMECs的RhoA活化狀態(tài)變化;直接免疫熒光檢測TNT-α作用不同時(shí)間后,BMECs的F-actin重組情況;跨膜電阻(Transendothelial electrical resistance,TER)檢測抑制RhoA表達(dá)對TNF-α刺激后BMECs通透改變的影響。
　　結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定表達(dá)n19RhoA及vector-1的Bend-3細(xì)胞株。Pull down證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)1 min后RhoA活化開始增加,30

6、min達(dá)到高峰;直接熒光證實(shí)TNF-α作用3hr后,F-actin發(fā)生重組,12 hr后達(dá)高峰;TER檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α導(dǎo)致BMECs通透性增高,TER下降,12 hr達(dá)到高峰,24 hr仍不能恢復(fù)正常。
　　結(jié)論：證實(shí)RhoA活化參與了TNF-α導(dǎo)致BMECs通透性增高的調(diào)控,抑制其活性可降低BMECs通透性。
　　第二部分TNF-α誘導(dǎo)RhoA活化及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的調(diào)控機(jī)制研究
　　目的：了解TNF-α

7、是否通過PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信號通路誘導(dǎo)RhoA活化并導(dǎo)致BMECs通透性增高。
　　方法：
　　1.將PLKO.1-puro-PKC-α-shRNA、PLKO.1-puro-PKC-β-shRNA、p115RhoGEF-shRNA和empty PLKO.1-puro vector分別導(dǎo)入Bend.3細(xì)胞,利用嘌呤霉素B篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。Wester blot分別鑒定PKC-α、PKC-β和p115Rh

8、oGEF蛋白的表達(dá)抑制情況。
　　2.經(jīng)典型PKC抑制劑(G(o)6976)預(yù)處理后,或穩(wěn)定表達(dá)上述質(zhì)粒的BMECs給予TNF-α刺激后,Pull down技術(shù)檢測RhoA活性,觀察抑制經(jīng)典型PKC、PKC-α、PKC-β和p115RhoGEF表達(dá)對TNF-α刺激后RhoA活化的影響;32p標(biāo)記上述各組細(xì)胞后,Western blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α刺激后p115RhoGEF的磷酸化水平,明確PKC亞型是通過磷酸化p115

9、RhoGEF參與了TNF-α誘導(dǎo)的RhoA活化;穩(wěn)定表達(dá)n19RhoA和p115-shRNA及相應(yīng)vector的BMECs給予TNF-α刺激后,體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測PKC活化水平,進(jìn)一步驗(yàn)證PKC是RhoA活化的上游調(diào)控信號。
　　3.將穩(wěn)定表達(dá)n19RhoA、PKCα-shRNA、p115-shRNA和vector的Bend.3細(xì)胞予TNF-α刺激3hr后,直接免疫熒光觀察F-actin的重組情況;TNF-α刺激后0～24 hr,T

10、ER觀察BMECs屏障功能的改變情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立穩(wěn)定表達(dá)PKCα-shRNA、PKCβ-shRNA、p115-shRNA及vector-2的Bend.3細(xì)胞株。
　　2.實(shí)驗(yàn)觀察到TNF-α作用Bend.3細(xì)胞0.5min后,導(dǎo)致PKC活化和p115RhoGEF磷酸化。經(jīng)典型PKC抑制劑G(o)6976預(yù)處理后明顯抑制了TNF-α導(dǎo)致的p115RhoGEF磷酸化以及RhoA活化,說明經(jīng)典型PKC參與

11、了TNF-α導(dǎo)致的RhoA活化的調(diào)控。利用PKCα-shRNA、PKCβ-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)PKC-α而不是PKC-β可以抑制TNF-α導(dǎo)致的RhoA活化。體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),抑制p115RhoGEF和RhoA的表達(dá),對PKC-α的活化沒有影響。
　　3.抑制RhoA、PKC-α、p115RhoGEF的表達(dá)可以減輕TNF-α導(dǎo)致的BMECs的F-actin重組及TER下降。
　　結(jié)論：以上證據(jù)提示,PKC-

12、α而不是PKC-β是p115RhoGEF磷酸化和RhoA活化的上游調(diào)控信號。PKC-α/p115RhoGEF/RhoA信號通路參與調(diào)控TNF-α導(dǎo)致的BMECs的F-actin重組及屏障功能破壞。
　　第三部分大鼠大腸桿菌腦膜炎時(shí)BBB通透性增加的機(jī)制研究
　　目的：探討大鼠大腸桿菌腦膜炎時(shí)BBB通透性增加的可能機(jī)制,了解PKC-α,p115RhoGEF和RhoA信號通路是否與大腸桿菌腦膜炎大鼠BBB通透性增加相關(guān)。

13、　　方法：大鼠小腦延髓池注射大腸桿菌建立大腸桿菌腦膜炎模型,并予行為學(xué)評分、腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)、H.E.和尼氏染色法鑒定。實(shí)驗(yàn)分腦膜炎模型組和生理鹽水對照組。各組大鼠腦組織行伊文思蘭半定量檢測鑒定其BBB通透性改變;RT-PCR了解TNF-α表達(dá)變化;pull-down和體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)分別檢測RhoA和PKC-α活化狀態(tài)變化;Western blot測定p115RhoGEF蛋白表達(dá)改變。
　　結(jié)果：成功建立大鼠大腸桿菌腦膜炎模型。伊文思