1、目的:
　　1.構建雙特異性雙鏈抗體BsDb(抗-PSMA×抗-FITC)的基因序列及質粒載體pET-28(a)-BsDb,將其轉入大腸桿菌中構成BsDb的原核表達體系,以IPTG誘導表達并純化。
　　2.培養(yǎng)人前列腺癌細胞系,檢測PSMA表達情況及鑒定雙特異性抗體BsDb的活性。
　　方法:
　　1.通過對本課題組先期測得的抗-PSMA單鏈抗體(ScFv-P)與抗-FITC單鏈抗體(ScFv-F)基因序列的分析

2、,獲得兩條ScFv各自的重鏈和輕鏈序列。通過VectorNTI9軟件將ScFv-P的重鏈(PVH)和輕鏈(PVL)與ScFv-F的輕重鏈(FVL和FVH)交叉連接,構成PVH-Linker-FVL和PVL-Linker-FVH兩條雜合鏈,將其連接后以全基因合成的方法合成BsDb的基因片段。在其C端設計一個XbaⅠ酶切位點,N端設計一個XhoⅠ酶切位點。將BsDb基因片段用XbaⅠ與XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶進行雙酶切并與經(jīng)過同樣雙酶切的p

3、ET-28(a)質粒載體用T4連接酶連接成pET-28(a)-BsDb,將其轉入大腸桿菌BL21,以IPTG誘導其表達,對表達產(chǎn)物用鎳親和層析柱進行純化。
　　2.培養(yǎng)人前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3和人胰腺癌細胞系PANC-1,利用Westernblot檢測PSMA在體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞系中的表達。
　　3.通過免疫細胞化學、Westernblot等檢測BsDb與PSMA結合的特異性,通過ELISA檢測其與FITC結

4、合的特異性。
　　結果:
　　1.成功構建BsDb基因序列,且將其成功導入pET-28(a)質粒中形成pET-28(a)-BsDb,將該質粒導入大腸桿菌BL21實現(xiàn)原核表達。通過對誘導劑IPTG濃度與溫度、搖床轉數(shù)、誘導時間等條件的選擇,最終摸索出實現(xiàn)BsDb可溶性表達的條件,即IPTG濃度選擇0.50‰,誘導溫度、搖床轉數(shù)和誘導時間分別為16℃,150rpm/min,12h。純化時目的蛋白通過鎳親和層析柱,其His標簽與鎳

5、親和層析柱結合,但同時亦有雜蛋白與鎳親和層析柱非特異性結合,選擇不同濃度梯度的咪唑液洗滌,低濃度的咪唑可以將非特異性結合的蛋白洗脫,而高濃度的咪唑才能將與鎳親和層析柱特異結合的目的蛋白洗脫,這時收集則為純化的BsDb,最終的咪唑濃度梯度為平衡液選10mmol/L,然后分別用40、120、500mmol/L濃度咪唑洗脫,500mmol/L的咪唑洗脫的為目的蛋白。純化后的BsDb通過BCA蛋白定量法測得其濃度為181μg/ml。
　　

6、2.人前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3以及人胰腺癌細胞系PANC-1均為單層貼壁生長;Westernblot證實PSMA在LNCaP細胞中高表達,而在其余兩種細胞系中不表達。
　　3.通過免疫細胞化學和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)BsDb與PSMA有良好的結合特性,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)其與FITC能特異性結合。
　　結論:
　　1.前列腺癌LNCaP細胞系高表達PSMA。
　　2.通過基因工程技術制備的雙特