1、生物體衰老是一個(gè)包含不同器官和系統(tǒng)的、發(fā)生一系列特定變化的復(fù)雜過程。皮膚衰老是機(jī)體衰老最直接的表現(xiàn)，本質(zhì)和基礎(chǔ)是皮膚細(xì)胞的衰老，其不僅受控于遺傳基因的調(diào)節(jié)，也受控于表觀遺傳的調(diào)控，后者是衰老發(fā)生的重要機(jī)制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及microRNA(miRNA)調(diào)控等。
　　miRNA-217是一種已知高表達(dá)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中的miRNA，已被證實(shí)其在胰腺導(dǎo)管腺癌中能通過靶向調(diào)控KRAS起到腫

2、瘤抑制因子的作用，還可靶向調(diào)節(jié)Runx2，從而影響成骨細(xì)胞成熟。在衰老機(jī)制的研究中，已有報(bào)道顯示，miR-217在衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并可通過抑制長壽基因Sirt1的表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。然而，至目前為止，miR-217對(duì)于皮膚衰老的作用研究還不清楚。本課題組前期通過miRNA芯片發(fā)現(xiàn)傳代衰老組與年青組人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts，HSF)比較，miR-217的表達(dá)量明顯增加。因此，我們

3、推測(cè)miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。
　　本研究通過三個(gè)部分證實(shí)miR-217在HSF衰老中的作用機(jī)制。第一部分:檢測(cè)比較年青組與衰老組HSF中miR-217的表達(dá)。第二部分:研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。通過在年青組HSF中過表達(dá)miR-217并檢測(cè)細(xì)胞衰老的表型及相關(guān)衰老蛋白的表達(dá)，以探討miR-217在細(xì)胞衰老中的作用。第三部分:研究miR-217調(diào)控HSF衰老的機(jī)制:(1)通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，

4、發(fā)現(xiàn)miR-217可能直接靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證明兩者的直接靶向關(guān)系;(2)在HSF中，檢測(cè)miR-217對(duì)DNMT1表達(dá)量的調(diào)節(jié)，及其通過DNMT1對(duì)細(xì)胞衰老調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　通過以上研究揭示miR-217能夠通過下調(diào)DNMT1來促進(jìn)HSF的衰老，為皮膚衰老的研究和治療領(lǐng)域提供新的方向。
　　第一部分年青組與衰老組人皮膚成纖維細(xì)胞中miR-217的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)自然

5、衰老與傳代衰老HSF中miR-217的表達(dá)水平。
　　方法:收取少年組（＜10歲）、中年組（30～50歲）與老年組(＞60歲)的正常人避光部位皮膚，原代培養(yǎng)HSF，并將少年組HSF進(jìn)行傳代（年青組:P3-5，衰老組:P20-25），采用Real-time PCR方法檢測(cè)miR-217的表達(dá)量。
　　結(jié)果:和少年組細(xì)胞比較，中年組、老年組HSF中的miR-217表達(dá)量明顯升高（中年組:P＜0.05，老年組:P＜0.01），其中

6、老年組較中年組細(xì)胞中miR-217的表達(dá)量也顯著升高(P＜0.01)。和年青組細(xì)胞比較，傳代衰老組細(xì)胞的miR-217的表達(dá)量亦明顯升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:自然衰老與傳代衰老的HSF中miR-217的表達(dá)明顯上升。
　　第二部分 miRNA-217對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的作用
　　目的:研究miR-217在HSF衰老過程中的作用。
　　方法:在年青組HSF中，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒和

7、陰性對(duì)照慢病毒，48小時(shí)后，采用Real-time PCR方法檢測(cè)miR-217的表達(dá)量，MTT法檢測(cè)HSF細(xì)胞增殖能力，衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)HSF的衰老相關(guān)染色率，western blot法檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P53、P21、sirt1等的改變。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染hsa-miR-217的慢病毒后，HSF中的miR-217表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.01)，細(xì)胞增殖能力明顯下調(diào)(P＜0.05)，衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P＜

8、0.01)，衰老相關(guān)蛋白P53、P21的表達(dá)量上升、sirt1表達(dá)量下降(P＜0.05)。
　　結(jié)論:過表達(dá)miR-217可明顯促進(jìn)HSF的衰老，miR-217在HSF的衰老過程中起到重要作用。
　　第三部分 miRNA-217直接調(diào)控HSF中DNMT1的表達(dá)及機(jī)制
　　目的:研究miR-217在HSF衰老過程中的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:通過MICRORNA.ORG網(wǎng)站預(yù)測(cè)DNMT1是否為hsa-miR-217可能

9、的直接靶向基因，并構(gòu)建DNMT1的3'UTR區(qū)域的野生型與突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染野生型與突變性DNMT1-3'UTR質(zhì)粒，4小時(shí)后將miR-217化學(xué)模擬物(mimics)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后溶解細(xì)胞，熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)分析熒光強(qiáng)度。構(gòu)建含DNMT1 shRNA序列的慢病毒載體，通過在年青組HSF中抑制DNMT1的表達(dá)量來檢測(cè)HSF的衰老表型。利用第二部分中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的年青組HSF，提取細(xì)胞總蛋白，利用we

10、sternblot法檢測(cè)DNMT1的蛋白表達(dá)量，并在過表達(dá)miR-217的年青組HSF中，轉(zhuǎn)染DNMT1-cDNA質(zhì)粒，衰老β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)HSF的衰老相關(guān)染色率。
　　結(jié)果:MICRORNA.ORG網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-217的3'UTR區(qū)域可以直接靶向DNMT1的序列。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，野生型的DNMT1-3'UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，過表達(dá)miR-217后，熒光量較未過表達(dá)組下降(P＜0.05)，而突變型的DNMT1-3

11、'UTR轉(zhuǎn)染組未發(fā)生明顯變化。年青組HSF中抑制DNMT1的表達(dá)量后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P＜0.05)，衰老β-半乳糖苷酶染色率明顯上升(P＜0.01);年青組HSF中過表達(dá)miR-217后，DNMT1的蛋白表達(dá)量明顯下降(P＜0.01);同時(shí)轉(zhuǎn)染含hsa-miR-217 shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒載體后，較單獨(dú)下調(diào)hsa-miR-217組，衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:DNMT