1、背景:
　　結(jié)直腸癌，又稱(chēng)大腸癌，是世界上第三大常見(jiàn)的惡性腫瘤。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率一直呈上升趨勢(shì)。直腸癌是大腸癌中最常見(jiàn)的一類(lèi)腫瘤，約占60％左右。惡性腫瘤的一個(gè)最主要生物學(xué)特征就是轉(zhuǎn)移，就是癌細(xì)胞從原發(fā)病灶遷移到其它部位形成轉(zhuǎn)移灶，并維持復(fù)發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其預(yù)后將極差。大多數(shù)癌癥患者并非死于原發(fā)性癌而是死于轉(zhuǎn)移性癌。因此，如何預(yù)防直腸癌轉(zhuǎn)移是直腸癌治療成敗的關(guān)鍵。盡管外科手術(shù)一直以來(lái)都是治療直腸癌的

2、主要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高。目前，術(shù)前放療已經(jīng)成為Ⅱ/Ⅲ期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)療法。放射治療可以最大限度地將放射線的劑量集中照射到病灶內(nèi)，殺滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)使周?chē)恼＝M織和關(guān)鍵器官免受或盡可能少受不必要的照射。術(shù)前放療可以使腫瘤降期、降體積，甚至達(dá)到病理學(xué)上的完全消失，從而提高手術(shù)的局部根治率，還可以減少術(shù)中腫瘤種植機(jī)會(huì)，減少術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)率，進(jìn)而提高患者的長(zhǎng)期生存率。但是術(shù)前放療使直腸癌細(xì)胞發(fā)生了哪些分子變化尚不清楚。
　　基因芯片技術(shù)

3、是一種高通量、快速、全基因組分析技術(shù)，是研究基因功能強(qiáng)有力的工具之一，現(xiàn)在已普遍應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。基因表達(dá)譜是一種生物體或一種細(xì)胞對(duì)環(huán)境、遺傳或者生化信號(hào)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，基因表達(dá)被激活或抑制數(shù)倍甚至數(shù)千倍，形成的特征性的基因表達(dá)圖譜。表達(dá)譜基因芯片可用來(lái)檢測(cè)基因的表達(dá)水平，通過(guò)比較不同條件下基因表達(dá)的差異情況，可分析疾病形成的基因水平原理、研究基因功能以及與疾病相關(guān)的通路，具有準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便兩大優(yōu)點(diǎn)?；蛐酒臄?shù)據(jù)分析通常都需要一定的流

4、程處理，也就是生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)是一門(mén)整合了統(tǒng)計(jì)學(xué)、信息學(xué)和計(jì)算機(jī)學(xué)等多種技術(shù)的交叉學(xué)科。該技術(shù)利用現(xiàn)有的分析工具和公共數(shù)據(jù)庫(kù)，先對(duì)生物芯片的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，再采用序列比對(duì)、統(tǒng)計(jì)分析、生物聚類(lèi)、功能或通路分析、可視化作圖等方式，挖掘關(guān)鍵生物分子及其潛在機(jī)制，從而在分子水平上對(duì)疾病進(jìn)行分析，豐富人們對(duì)疾病發(fā)生、治療和預(yù)后等方面的認(rèn)識(shí)。隨著各種模式生物基因組測(cè)序工作的完成，生物信息學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了功能基因組學(xué)時(shí)代。功能基因組學(xué)利用結(jié)構(gòu)

5、基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段，通過(guò)在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。目前，利用基因表達(dá)譜芯片來(lái)分析術(shù)前放療對(duì)直腸癌分子學(xué)方面的影響還很少。
　　目的:
　　(1)通過(guò)放療前后直腸癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析，篩選放療后直腸癌中的差異表達(dá)基因(DEG)，并分析它們參與的功能和通路以及相互作用關(guān)系，預(yù)測(cè)調(diào)控這些DEG的microR

6、NA和轉(zhuǎn)錄因子(TF)，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找出放療后直腸癌中發(fā)生顯著變化的基因和關(guān)鍵功能通路，從分子層面揭示術(shù)前放療治療直腸癌的分子機(jī)制。
　　(2)驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，并檢測(cè)在相關(guān)基因沉默前和沉默后，直腸癌細(xì)胞增殖能力和轉(zhuǎn)移能力的變化，以及不同X射線放射劑量對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖能力和轉(zhuǎn)移能力的影響，為臨床放射治療直腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)從GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)里下載直腸癌放療前后的mRNA表達(dá)譜數(shù)

7、據(jù)，利用Bioconductor中的limma軟件包對(duì)該數(shù)據(jù)集中所有樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出放療后直腸癌細(xì)胞中的DEG（差異倍數(shù)大于1，并且p值小于0.05），并利用DAVID在線軟件對(duì)這些DEG進(jìn)行GO(Gene Ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析（p值小于0.05）;利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析DEG對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，并用C

8、ytoscape作圖軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò);利用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)找出DEG中的TF，確定它們調(diào)控的差異表達(dá)基因，然后利用Cytoscape作圖軟件來(lái)構(gòu)建它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后利用多個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)找出DEG與miRNA的調(diào)控關(guān)系，利用Cytoscape作圖軟件來(lái)構(gòu)建它們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　(2)選取放療后直腸癌細(xì)胞中差異表達(dá)倍數(shù)較大，并且與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移功能相關(guān)的基因作為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的對(duì)象，選用高轉(zhuǎn)移性、惡性程度高的結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW620

9、為研究材料，利用MTT法和Transwell法檢測(cè)不同X射線放射劑量對(duì)SW620細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力的影響，用RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不同劑量的X射線輻照對(duì)SW620細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。采用siRNA法沉默相關(guān)基因，并用RT-PCR和western blot檢測(cè)沉默效果。同樣地，利用MTT法和Transwell法檢測(cè)相關(guān)基因沉默后SW620細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)果:
　　(1)通過(guò)基因表達(dá)譜分析，共篩選出60

10、6個(gè)在放療后直腸癌中差異表達(dá)的基因（表達(dá)差異1倍以上，并且p值小于0.05），其中上調(diào)基因271個(gè)，下調(diào)基因335個(gè)，其中MMP1的差異表達(dá)倍數(shù)最大，且p值最小。
　　(2) GO功能富集分析結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的差異基因主要顯著富集在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、對(duì)無(wú)機(jī)物和金屬離子的應(yīng)答等功能上，如SLC6A3、SLC30A4、RYR2和NEDD4L等。表達(dá)下調(diào)的差異基因主要和細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖以及膠原代謝有關(guān)，其中SLC6A4和PDX1等參與了細(xì)

11、胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，PTGS2和CDH5等基因參與了細(xì)胞的增殖調(diào)控，而MMP10、COL1A1、MMP3和MMP1主要和膠原蛋白的代謝過(guò)程有關(guān)。
　　(3) KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)的差異基因主要顯著富集在甾類(lèi)激素的生物合成、鈣信號(hào)通路、雄性激素和雌性激素的新陳代謝、刺激神經(jīng)組織的配體和受體相互作用以及年輕人的成年型糖尿病這5條通路上，其中HSD382、UGT2A3、SULT1E1和UGT2815這4個(gè)基因參與了甾類(lèi)

12、激素的生物合成通路以及雄性激素和雌性激素的新陳代謝通路，CYSLTR2、CHRM1和HTR6這3個(gè)基因主要參與了鈣信號(hào)和刺激神經(jīng)組織的配體和受體相互作用這兩條通路。表達(dá)下調(diào)的差異基因顯著富集在細(xì)胞外基質(zhì)與受體的相互作用以及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)這兩條通路上，其中COL4A2、COL4A1和COL6A3等7個(gè)編碼膠原蛋白的基因參與細(xì)胞外基質(zhì)與受體的相互作用這條通路上，SERPINE1、SERPIND1、F7、PLAU和F2R這5個(gè)基因主要參與補(bǔ)體

13、和凝血級(jí)聯(lián)通路。
　　(4) DEG的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)共包含241個(gè)蛋白的410個(gè)相互作用關(guān)系對(duì)，連接度大于等于10的節(jié)點(diǎn)共有20個(gè)。其中COL1A2和COL1A1的連接度都是18，MMP1的連接度是11。
　　(5)通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)分析，共找出5個(gè)是TF的差異表達(dá)基因，包含PAX6、PLAU、FOXL1、NKX2-2和FOSL1。在DEG與TF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，共有77個(gè)調(diào)控關(guān)系對(duì)，其中，PLAU除了調(diào)控MM

14、P1、COL1A1等DEG，還調(diào)控NKX2-2和PAX6這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。
　　(6)通過(guò)7個(gè)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合分析，共篩選出177對(duì)miRNA和差異基因的調(diào)控關(guān)系，包含145個(gè)miRNA和40個(gè)差異表達(dá)基因，如hsa-miR-29e調(diào)控COL1A1、COL1A2、COL4A1和COL4A2這4個(gè)基因，MMP1被hsa-miR-222調(diào)控，MMP3被hsa-miR-204調(diào)控。
　　(7)選取MMP1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。MMP1

15、沉默前，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SW620細(xì)胞中MMP1的mRNA水平在0.1 GY、0.5 GY、1 GY、3 GY和6 GY這5種輻射劑量下，相對(duì)于空白對(duì)照組(0 GY)都是降低的，并且輻射劑量在0.5 GY內(nèi)，MMP1的表達(dá)量隨著輻射劑量的增加大幅度降低。
　　(8)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MMP1沉默前，SW620細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力明顯高于沉默后的（p值小于0.5），并且在輻射劑量6 GY內(nèi)，S

16、W620細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力隨著輻射劑量的增加逐漸下降。
　　結(jié)論:
　　(1)放射治療使直腸癌中一些參與金屬離子應(yīng)答的基因（如SLC6A3、SLC30A4、RYR2和NEDD4L）、參與鈣離子信號(hào)通路與刺激神經(jīng)組織的配體和受體相互作用通路的基因（如CYSLTR2和CHRM1）、與細(xì)胞增殖調(diào)控和補(bǔ)體凝血級(jí)聯(lián)有關(guān)的基因（如PLAU、FOSL1和SERPINE1）、參與膠原代謝的基因（如MMP1和MMP3）以及一些參與細(xì)胞外

17、基質(zhì)與受體的相互作用通路的基因（如COL1A2、COL1A1和COL4A1等）發(fā)生了明顯的表達(dá)量變化，這些基因?qū)Ψ暖煯a(chǎn)生了顯著的應(yīng)答反應(yīng)。
　　(2)對(duì)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用的一些miRNAs(如hsa-miR-29c、hsa-miR-224、hsa-miR-204和hsa-miR-222)，以及一些轉(zhuǎn)錄因子（如PLAU和FOSL1等），可能在直腸癌的放療過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。
　　(3)不同劑量的X射線輻射能使SW6