1、目的:構(gòu)建、誘導表達重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1,體外驗證其生物活性和靶向性。通過小鼠日本血吸蟲感染模型,觀察重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1對肝臟蟲卵肉芽腫形成的抑制作用并研究其可能的作用機制,進一步搜尋和鑒定IL-21/Th17信號通路在血吸蟲肉芽腫形成和發(fā)展中的作用。
　　方法:采用基因工程技術將重組基因片段mIL-21-LuffinP1克隆入表達載體Pet32a(+)中,經(jīng)酶切和DNA序列測定正確后

2、,轉(zhuǎn)化至表達宿主菌BL21中,經(jīng)IPTG誘導表達mIL-21-LuffinP1融合蛋白。通過MTT和流式細胞術,體外檢測重組毒素mIL-21-LuffinP1的細胞毒性和靶向性。通過小鼠日本血吸蟲感染模型,病理學分析mIL-21-LuffinP1對肝臟蟲卵肉芽腫形成的抑制作用,實時熒光定量PCR法檢測小鼠肝臟中Th17相關細胞因子IL-17、轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt和炎癥趨化因子CXCL1、CXCL2mRNA表達水平。
　　結(jié)果:成功

3、構(gòu)建重組免疫毒素表達載體Pet32a(+)-mIL-21-LuffinP1,并誘導蛋白表達。MTT法顯示mIL-21-LuffinP1能夠明顯抑制表面高表達IL-21R的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的增殖,其抑制效應呈濃度依賴性增強,流式雙染SP2/0細胞表面標記IL-21R和AnnenixV,顯示mIL-21-LuffinP1可以針對表面表達IL-21R細胞誘導細胞凋亡,即具有靶向性。以小鼠日本血吸蟲感染模型,感染第四周開始尾靜脈注射mI

4、L-21-LuffinP1或LuffinP1,感染6周后剖殺小鼠,通過肝臟切片HE染色和肉芽腫面積統(tǒng)計分析,顯示mIL-21-LuffinP1具有體內(nèi)抑制肉芽腫病變的作用(P<0.05),而注射LuffinP1組小鼠肝臟肉芽腫病變程度與空白對照組相比無明顯差異(P>0.05)。與空白對照組相比,雖然mIL-21-LuffinP1組小鼠肝臟炎癥趨化因子CXCL1、CXCL2mRNA水平無明顯差異(P>0.05),但炎性細胞因子IL-17m

5、RNA水平明顯降低(P<0.05)。值得注意地是,mIL-21-LuffinP1組小鼠肝臟中Th17上游轉(zhuǎn)錄因子ROR-γtmRNA水平并沒有出現(xiàn)預期的降低趨勢,相反,其mRNA水平總體呈上升趨勢,且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建并表達純化出重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1,并驗證其具有細胞毒性和靶向性;小鼠實驗結(jié)果表明,重組免疫毒素mIL-21-LuffinP1可以明顯抑制感染日本血吸蟲小鼠肝臟肉