1、原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是全世界排名第六位的最常見惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年上升。雖然腫瘤切除及肝移植大大提高了早期肝癌患者的生存率，但是高復(fù)發(fā)風(fēng)險仍然危害著患者的預(yù)后健康，術(shù)后5年內(nèi)仍有50％-70％復(fù)發(fā)率。因此，深入研究肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機制，通過機制的研究來探尋有效的對抗轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療，已經(jīng)成為現(xiàn)今肝癌防治以及預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)的重點之一。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步

2、驟的復(fù)雜動態(tài)過程。包括染色體水平的改變，癌基因表達(dá)的增加，抑癌基因的失活，與肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的細(xì)胞因子、受體及粘附分子的表達(dá)，某些信號通路的改變等。許多研究已經(jīng)證明某些癌基因的表達(dá)增加與肝癌發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后有著明顯關(guān)系。
　　腫瘤神經(jīng)腹側(cè)抗原-1(Neuro-oncological ventral antigen-1，No va1)基因是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性的RNA結(jié)合蛋白。其作為一種神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗原，首先在副腫瘤性斜視眼陣

3、攣-肌陣攣共濟(jì)失調(diào)(Paraneoplastic Opsoclonus-Myoclonus Ataxia,POMA)患者中被發(fā)現(xiàn)。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Nova1在惡性腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)。但至今未有研究報道關(guān)于Nova1在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)。
　　本研究探討了Nova1在人肝癌組織中的表達(dá)情況及同時通過各種體內(nèi)體外實驗了解Nova1基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義和潛在作用機制，初步證明Nova1基因是肝癌發(fā)生相關(guān)的新的易感基因。

4、　　本研究分為三部分:
　　第一部分 Nova1在人肝癌組織中的表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系我們采用免疫組化法檢測了Nova1在91例肝癌組織和配對癌旁組織中的表達(dá)，同時我們隨機選取了四對肝癌和癌旁組織，提取組織蛋白后通過免疫印跡法檢測Nova1蛋白表達(dá)量。免疫組化及免疫印跡法均提示Nova1在肝癌組織中的表達(dá)水平高于配對癌旁組織。進(jìn)一步結(jié)合臨床隨訪資料后發(fā)現(xiàn)肝癌組織Nova1陽性表達(dá)是影響總生存率(Overall surviv

5、al rate，OS)、至復(fù)發(fā)生存率(Time to recurrencerate，TTR)、早期復(fù)發(fā)的獨立危險因素。Kaplan-Meier生存曲線顯示，癌內(nèi)高表達(dá)Nova1的患者OS和TTR要顯著低于低表達(dá)組。而癌旁Nova1高表達(dá)患者OS和TTR與低表達(dá)患者相比無明顯差異。這一部分研究提示，Nova1可能與HCC患者預(yù)后相關(guān)，在HCC的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中起一定作用。
　　第二部分 Nova1誘導(dǎo)型表達(dá)載體的構(gòu)建及體外對肝癌細(xì)胞生物學(xué)

6、行為的影響第二部分中，我們進(jìn)一步構(gòu)建和驗證了Nova1干擾和過表達(dá)的誘導(dǎo)型載體的單克隆細(xì)胞株。誘導(dǎo)型表達(dá)載體是通過強力霉素(Doxycycline，Dox)來誘導(dǎo)基因的過表達(dá)和下調(diào)。隨后通過一系列體外細(xì)胞功能實驗，進(jìn)一步證實了與對照組相比，Nova1下調(diào)后，其肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力能明顯減弱;另一組，過表達(dá)Nova1后細(xì)胞增殖和遷移能力相比于對照組明顯增強。提示Nova1可能是通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞

7、的增殖及術(shù)后的復(fù)發(fā)。
　　第三部分體內(nèi)Nova1對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其促進(jìn)肝癌發(fā)展的潛在機制探討
　　第三部分中，我們首先行裸鼠體內(nèi)皮下成瘤實驗。實驗組裸鼠給予Dox加入飲用水中濃度為1mg/ml;對照組正常飲食不加Dox。實驗結(jié)果提示，Nova1過表達(dá)對肝癌腫瘤具有促進(jìn)生長的作用，而相反下調(diào)Nova1能夠抑制肝癌腫瘤生長。進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇Nova1參與的可變剪接GABAA受體γ2(GABAARγ2)進(jìn)行

8、深入研究。免疫組化及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)Nova1表達(dá)下調(diào)的同時，GABAARγ2存在表達(dá)上調(diào)，而相反的Nova1過表達(dá)后，GABAARγ2表達(dá)下調(diào);GABA的表達(dá)量與GABAARγ2的表達(dá)量呈現(xiàn)相同的趨勢。免疫共沉淀提示Nova1與GABAARγ2不僅僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在相互作用，在外周腫瘤組織中同樣存在相互作用。我們猜想，肝腫瘤細(xì)胞異位表達(dá)的Nova1，通過下調(diào)GABAARγ2的表達(dá)，進(jìn)一步使得GABAARγ2介導(dǎo)的氯離