1、目的：以杜仲藥材有效部位提取物為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平上考察其抗骨質(zhì)疏松藥效作用，闡明杜仲藥材抗骨質(zhì)疏松作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。
　　方法：（1）采用大孔樹脂吸附法分離杜仲化學(xué)組分并用高效液相（UPLC）進(jìn)行圖譜比對(duì)以探究組分制備的合理性；以對(duì)MC3T3-E1 subclone14成骨細(xì)胞及SAO-2人成骨細(xì)胞存活率、堿性磷酸酶活性、骨保護(hù)素（OPG）活性的影響，篩選杜仲抗骨質(zhì)疏松有效活性組分（2）在杜仲各化學(xué)組分UPLC圖譜

2、比對(duì)的基礎(chǔ)上,借助超高液相色譜–電噴霧–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)杜仲促成骨細(xì)胞增殖有效組分的化學(xué)成分進(jìn)行質(zhì)譜分析研究。（3）采用 MC3T3-E1 subclone14成骨細(xì)胞存活率來(lái)篩選杜仲有效活性化學(xué)成分，然后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)和Western blot(蛋白質(zhì)印跡)技術(shù)從分子水平研究杜仲有效部位中的主要化合物對(duì)MC3T3-E1 subclone14成骨細(xì)胞中OPG，RANKL，RUNX-2，Os

3、terix及TRACP等基因表達(dá)的影響，同時(shí)使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)杜仲有效組分中的主要化合物對(duì)MC3T3-E1 subclone14成骨細(xì)胞中Ca2+，ALP，M-CSF及OTC等因子活性的影響。
　　結(jié)果：通過比對(duì)杜仲各化學(xué)組分高效液相(UPLC)圖譜發(fā)現(xiàn)水煎煮提取法明顯優(yōu)于乙醇回流提取法，水煎煮提取物經(jīng) D101大孔樹脂分段后各組分基本無(wú)交叉。杜仲水提取物經(jīng) D101大孔樹脂分離所得40％乙醇組分對(duì)成骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、促分化成熟

4、及促進(jìn)OPG分泌水平的作用。利用超高液相色譜–電噴霧–串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)40%乙醇組分進(jìn)行質(zhì)譜分析比對(duì)，共指認(rèn)10個(gè)化合物：京尼平苷酸、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄苷、刺五加苷E、松脂醇單葡萄苷、紫云英苷、黃芩苷。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，京尼平苷酸、咖啡酸、紫云英苷、黃芩苷具有促成骨細(xì)胞增殖的作用并且能顯著提高Ca2+、ALP、M-CSF及OTC因子的表達(dá)，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化的能

5、力。紫云英苷、黃芩苷能促進(jìn)Ca2+及OTC的分泌。4個(gè)化合物中只有京尼平苷酸能明顯抑制M-CSF因子減少成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸和京尼平苷酸能顯著的上調(diào)OPG/RANKL系統(tǒng)的表達(dá)。黃芩苷、紫云英苷還能提高RUNX-2蛋白的閾值，同時(shí)Osterix蛋白水平也隨著黃芩苷濃度升高而顯著上升。利用RT-PCR方法對(duì)成骨細(xì)胞TRACP因子考察發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸能濃度依賴性的抑制TRACP因子的

6、活性。
　　結(jié)論：杜仲40%乙醇組分是促成骨細(xì)胞增殖及分化成熟活性組分，該組分中的化合物紫云英苷、黃芩苷、京尼平苷酸和咖啡酸是杜仲抗骨質(zhì)疏松的活性成分。京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸具有顯著性的提高成骨細(xì)胞分化成熟的能力并且京尼平苷酸還能抑制成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞，維持成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡。同時(shí)京尼平苷酸、紫云英苷、黃芩苷、咖啡酸能上調(diào) OPG/RANKL系統(tǒng)改善骨重建；紫云英苷、黃芩苷加強(qiáng)鈣離子與骨組織的結(jié)合能力輔助改