1、目的:采用高效液相色譜法(HPLC)及甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分子標(biāo)記技術(shù)分析枇杷葉的甲基化情況，并研究枇杷葉中的主要化學(xué)成分熊果酸和齊墩果酸與甲基化情況的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.從福建采集43份枇杷嫩葉及成熟掛樹葉，嫩葉采集時(shí)用冰壺保存。
　　2.根據(jù)枇杷葉化學(xué)成分特性，改良傳統(tǒng)的CTAB法提取分離總基因組DNA，以獲得較純凈的DNA;并用紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA純度與濃度。

2、　　3.70％高氯酸酸解法水解總基因組DNA，95℃水浴50min分離堿基片段與蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)。反相高效液相色譜法檢測(cè)胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的含量，并計(jì)算甲基化率。
　　4.采用正交設(shè)計(jì)的方法分別對(duì)MSAP的主要步驟即預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，最后采用敏感性和分辨率均較高的6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色檢測(cè)選擇性擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)條帶的不同位置分析甲基化類型和情況。
　　5.反相高效液相色譜法測(cè)定枇杷葉中主要

3、化學(xué)成分熊果酸與齊墩果酸的含量。
　　6.采用SPSS18.0及Origin8.0等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1.采用改良的CTAB法提取的DNA主帶明顯，無(wú)雜帶，OD260/280在1.98～2.15之間表明無(wú)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾，OD260/230在1.79～2.25間表明無(wú)多糖、多酚等雜質(zhì)，純度較高，可以用于之后的分析。
　　2.采用的高效液相色譜條件可以將胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶分離，根據(jù)公式甲基化率=5

4、mC/(5mC+C)％，計(jì)算甲基化率，結(jié)果表明43份樣品的甲基化率在4.97％～33.21％。
　　3.通過(guò)正交試驗(yàn)得到最佳的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系即鏈接產(chǎn)物用量為3μL，E00、H00各105ng，dNTPs0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶2U，及最佳的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系即1.5UTaqDNA聚合酶、0.25mmol/LdNTPs、引物37.5pmol、Mg2+2mmol/L、連接產(chǎn)物稀釋30倍。通過(guò)驗(yàn)證該反應(yīng)條件下能得到較多清

5、晰的條帶，可以用于枇杷葉甲基化情況的分析。
　　4.NTsys-pcversion2.10e軟件對(duì)MSAP分析結(jié)果表明19個(gè)樣本間的相似系數(shù)在0.6125～0.9625之間，總甲基化率在3.24％～6.73％之間。
　　5.HPLC法測(cè)定枇杷葉中熊果酸及齊墩果酸含量表明不同品種間含量差異較大，總均值表明白梨品種的齊墩果酸及熊果酸含量均最高，熊果酸烏躬白品種含量最低，熊果酸解放鐘品種含量最低。
　　結(jié)論:
　　1.

6、DNA甲基化受品種及地理因素的影響。本實(shí)驗(yàn)將6個(gè)品種及4個(gè)產(chǎn)地的枇杷嫩葉進(jìn)行甲基化分析，表明品種間及產(chǎn)地間的甲基化水平有顯著性差異。華亭產(chǎn)枇杷葉甲基化率最高，長(zhǎng)基產(chǎn)枇杷葉的最低。
　　2.不同品種枇杷葉的甲基化模式不同，早鐘6號(hào)的甲基化類型以全甲基化為主，而解放鐘則以半甲基化為主。
　　3.對(duì)枇杷葉中熊果酸、齊墩果酸與半甲基化率、全甲基化率均成一定的負(fù)性相關(guān)。但不能確定是否與總甲基化率有相關(guān)性。
　　4.根據(jù)HPLC與