1、目的:
　　1、成功構建大鼠腎上腺髓質素真核表達質粒(PVAX1-ADM)
　　2、探討重組腎上腺髓質素對大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的影響及其作用機制。
　　方法:
　　1.取雄性SD大鼠腎上腺組織進行總RNA的提取,RT-PCR方法得到ADM基因,進行TA克隆連接到T載體上,進一步亞克隆到pVAX1真核表達載體上,得到重組質粒pVAX1-ADM。
　　2.雄性SD大鼠30只,體重200±10g,按體重隨機

2、分為5組,每組6只,即空載體組(pVAX1)、200μg重組質粒組、400μg重組質粒組、600μg重組質粒組和800μg重組質粒組。5組動物皮瓣注射含重組質粒(pVAX1-ADM)的量分別為0μg、200μg、400μg、600μg和800μg,每周1次,注射4周。取注射部位皮瓣組織,進行RT-PCR、提蛋白進行western blot檢測,以及進行免疫組織學檢查,測定重組質粒的轉錄水平和蛋白表達水平,獲取重組質粒最適注射劑量。

3、>　　3.雄性SD大鼠32只,體重200±10g,按體重隨機分為4組,每組8只,即正常對照組、缺血再灌注(IR)模型組、陽性藥物組(維拉帕米組)、重組質粒組。術前,重組質粒組皮瓣注射重組質粒600μg,其他三組注射與質粒溶液等量的生理鹽水,每周1次,共4周。4周后進行缺血再灌注實驗,缺血9h,再灌注12h。術中,維拉帕米組于再灌注前10分鐘,腹腔注射維拉帕米溶液2mg/kg,其他三組注射等量生理鹽水。術畢,取皮瓣組織測定MDA、SOD、

4、ET-1的含量,取血清測定CK、LDH、TNF-α的水平,及于術后7天對皮瓣組織進行組織病理學檢查。
　　結果:
　　1.獲得的大鼠腎上腺髓質素基因的測序結果與GeneBank中序列進行比對,完全一致。真核表達質粒經PCR后、用XbaI和HindIII雙酶切鑒定顯示,重組質粒為陽性。分光光度法對提取的重組質粒進行測定,結果為OD260/280=1.85±0.05,質粒濃度為4.0 mg/mL。
　　2.定量RT-PCR

5、、western blot和免疫組織化學方法對注射重組質粒的大鼠皮瓣組織進行測定,結果顯示,組織中的表達量隨重組質粒注射量的增加而增加,但600μg與800μg組之間相差不明顯。
　　3.與 IR模型組相比,重組質粒組皮瓣組織中 SOD的含量增加了50.67％(p﹤0.05),MDA的含量降低38.50%(p﹤0.01), ET-1的含量降低了54.73%(p﹤0.01);血清 CK的含量降低了53.84%(p﹤0.05),LDH

6、的含量降低了29.18%(p﹤0.01),TNF-α的含量降低了53.89%(p﹤0.01)。與維拉帕米組相比,重組質粒組皮瓣組織中MDA的含量增加了8.61%(p﹥0.05),SOD的含量減少了15.84%(p﹥0.05),ET-1含量雖增加了9.53%(p﹥0.05);血清中CK的含量增加了11.93%(p﹥0.05),LDH的含量增加了33.51%(p﹤0.05),TNF-α的含量降低了18.19%(p﹥0.05)。皮瓣組織學檢查

7、結果顯示:與對照組相比,重組質粒組和維拉帕米組皮瓣僅有少量壞死發(fā)生和炎性細胞浸潤,皮瓣水腫,間質水腫也較對照組明顯減輕。
　　結論:
　　1.目的基因 ADM成功連接到真核表達載體中,提取的重組質粒濃度為4.0 mg/mL。
　　2.重組質粒的注入可使大鼠腹部皮瓣ADM表達量提高,其中600μg重組質粒組為最佳劑量組,選擇應用于后續(xù)實驗。
　　3.大鼠皮瓣組織ADM表達量提高,可以減輕脂質過氧化,抑制氧自由基釋放