1、[研究背景和目的]
　　 原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界上最常見的實體惡性腫瘤之一，嚴重影響人類的健康，在我國每年肝癌的發(fā)病率為20.37/10萬，其死亡率高居癌癥死亡率的第二位。目前，手術切除和肝移植仍是目前最有效的治療手段，但療效不佳，術后復發(fā)和轉移是其最主要原因。HCC是個血供豐富的惡性腫瘤，血管生成被認為與HCC的侵襲轉移密切相關。因此進一步探討腫瘤血管生成在HCC侵襲轉移

2、中的分子機制有重要的理論意義和潛在的臨床實用價值。
　　 血管內皮細胞生長因子(vasculaurendothelialgrowthfactor，VEGF)是腫瘤血管生成中最主要的刺激因子，與HCC的侵襲轉移和血管生成密切相關，被認為是HCC血管生成中最主要的刺激因子。Vasohibin-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一個可以被VEGF或成纖維細胞生長因子2(FGF-2)誘導的血管生成負反饋抑制因子，因研究發(fā)現(xiàn)vasohibin-1參與腫瘤

3、、視網膜疾病等血管新生異常疾病的發(fā)生、發(fā)展備受關注。
　　 目前已有研究發(fā)現(xiàn)vasohibin-1在乳腺癌、子宮內膜癌、宮頸癌等有高表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。但在肝癌中尚未有相關研究?；谝陨涎芯勘尘?，本課題主要分析肝癌組織、肝癌細胞株中vasohibin-1基因/蛋白的表達水平;構建靶向人vasohibin-1特異性RNA干擾慢病毒表達載體，體外轉染人高表達vasohibin-1肝癌細胞株，沉默肝癌細胞中vasohi

4、bin-1基因的表達，研究vasohibin-1基因被抑制后VEGF-A、MMP-9基因/蛋白水平的變化，以及對細胞周期、凋亡和增殖的影響，分析vasohibin-1作為新候選基因在調節(jié)肝癌血管生成中作用，初步探討vasohibin-1參與調節(jié)肝癌血管生成的可能分子機制以及慢病毒介導RNAi沉默vasohibin-1基因在肝癌基因治療中的應用前景，以開辟治療肝癌的新途徑。
　　 [方法]
　　 1.Vasohibin-1

5、蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義:選取山東省立醫(yī)院病理科存檔且臨床病理資料完整的117例肝癌組織及相應癌旁組織，應用免疫組織化學方法檢測vasohibin-1、VEGF-A及腫瘤微血管密度(MVD，CD34標記)的表達，分析vasohibin-1、VEGF-A和CD34的表達相關性以及和肝癌患者臨床病理特征的關系;采用Kaplan-Meier法回顧性分析vasohibin-1蛋白表達與肝癌患者生存期的關系;應用COX回歸模型分析單因素和

6、多因素危險系數(shù)，尋找提高肝癌預后評價敏感性和特異性的相關指標。
　　 2.Vasohibin-1基因/蛋白在不同肝癌細胞株和人正常肝細胞中的表達:采用免疫細胞化學、熒光定量PCR(RealtimePCR)及Westemblot技術檢測不同侵襲、轉移潛能肝癌細胞株中HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L及人正常肝細胞株L-02中vasohibin-1的表達情況，篩選出高表達vasohibin-1肝癌細胞

7、株。
　　 3.慢病毒介導的肝癌細胞vasohibin-1基因沉默:構建U6啟動子驅動、帶有綠色熒光蛋白(GFP)標志的、表達針對vasohibin-1基因的慢病毒RNAi載體，轉染vasohibin-1高表達肝癌細胞，同時以轉染陰性載體的肝癌細胞作為對照。熒光顯微鏡觀察GFP表達以確定轉染效率，通過RealtimePCR、westem-blot分別檢測細胞轉染后vasohibin-1基因和蛋白的表達情況，明確RNAi的抑制效率

8、，篩選出vasohibin-1沉默效率最高的干擾片段。
　　 4.Vasohibin-1沉默對肝癌細胞生物學行為的影響:將篩選出的最佳慢病毒pGCSIL-vasohibin-1RNAi載體轉染肝癌細胞，沉默vasohibin-1的基因表達，通過四唑鹽比色法(MTT)檢測vasohibin-1干擾后對hepG2細胞增殖能力的變化;通過細胞劃痕實驗檢測vasohibin-1沉默后hepG2細胞遷移能力變化;應用流式細胞技術檢測vas

9、ohibin-1沉默對hepG2細胞周期和凋亡的影響。RealtimePCR和westernblot方法檢測hepG2細胞轉染pGCSIL-vasohibin-1RNAi后VEGF-A和MMP-9的表達變化，探討vasohibin-1參與調節(jié)肝癌血管生成的可能分子機制。
　　 [結果]
　　 1.Vasohibin-1蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義:免疫組化檢測結果顯示vasohibin-1蛋白在117例肝癌組織中的總

10、陽性表達率為38.5％，明顯高于正常組織中陽性表達16.2％。且與肝癌組織表達的VEGF-A、CD34以及肝癌血管侵襲特征密切相關(P=0.014，0.035，和0.002)。隨訪發(fā)現(xiàn)，vasohibin-1高表達患者5年復發(fā)率高，生存率明顯低于vasohibin-1低表達患者。將vasohibin-1表達，臨床病理特點等參數(shù)與肝癌患者復發(fā)和生存時間進行單因素和多因素分析，結果顯示vasohibin-1，VEGF-A和腫瘤TNM是影響肝

11、癌復發(fā)和生存預后的獨立因素(P=0.002、0.006、0.022)。
　　 2.Vsohibin-1基因/1蛋白在肝癌細胞株和正常肝細胞株中的表達情況:RealtimePCR和western-blot檢測證實肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402和MHCC-97L中vasohibin-1基因和蛋白水平明顯高于人正常肝細胞株L-02，而且以hepG2中vasohibin-1表達含量最高，統(tǒng)計學分析差異具有統(tǒng)計

12、學意義。細胞免疫組織化學證明vasohibin-1表達在hepG2細胞胞漿。
　　 3、慢病毒介導的肝癌細胞vasohibin-1基因沉默:以vasohibin-1mRNA基因序列為靶目標進行干擾片段設計，成功構建了四對針對vasohibin-1基因不同位點的特異性RNA干擾序列，經化學修飾后與pGCSIL-GFP慢病毒載體連接，通過轉化，挑選陽性克隆進行測序，鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點完全正確;在293T細胞中包裝慢病毒

13、，獲得高滴度慢病毒上清;利用重組慢病毒載體將vasohibin-1RNAi轉導入肝癌細胞hepG2中，熒光顯微鏡測定轉染效率可達到80％以上，RealtimePCR結果顯示:pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1，2，3，4組中vasohibin-1mRNA相對表達量分別為空白對照組的33.1％，56.5％，48.3％和81.6％;Westernblot結果顯示，pGCSIL-vasohibin-1RNAi-1，2，3，4組v

14、asohibin-1蛋白相對表達水平與空白對照組相比下降，其中，又以vasohibin-1RNAi靶點1效果最好(P＜0.05)。綜合RealtimePCR和Westernblot結果，4組干擾片段中，vasohibin-1RNAi靶點1的干擾效果最高。因此，選用vasohibin-1RNAi靶點1干擾片段進行后續(xù)實驗。
　　 4、Vasohibin-1沉默對肝癌細胞生物學行為的影響:MTT法觀察vasohibin-1基因表達沉

15、默后體外細胞的增殖情況，與未轉染細胞相比，細胞的增殖速度明顯減慢，與呈時間依賴關系，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示下調vasohibin-1基因表達抑制hepG2細胞增殖，使其生長速度減緩;細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)vasohibin-1RNAi轉染后對hepG2細胞的運動干擾影響不明顯(P＞0.05);流式細胞術檢測vasohibin-1基因表達沉默后體外細胞的周期和凋亡情況，與未轉染細胞相比，細胞周期中S期的比例明顯減少，G2/M期明

16、顯增多，細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示抑制vasohibin-1基因表達影響hepG2細胞周期的進程，使細胞周期阻滯于G2/M期，而且細胞凋亡細胞增多;RealtimePCR和western-blot顯示利用RNAi技術沉默vasohibin-1基因表達，與未轉染細胞相比，vasohibin-1基因下調后對MMP-9的基因/蛋白表達水平沒有影響，卻可以在基因/蛋白質水平下調VEGF-A的表達，差別有統(tǒng)計學意義(P

17、＜0.05)。
　　 [結論]
　　 1.Vasohibin-1蛋白在肝癌組織中高表達，在癌旁組織中弱表達，且與肝癌的血管侵襲、VEGF-A，CD34表達有相關性，而且與患者預后有關，表明vasohibin-1可能是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子，vasohibin-1可作為臨床檢測的有重要參考價值的標志物，對判斷肝癌預后有重要意義;
　　 2.RNAi慢病毒轉染細胞hepG2后，vasohibin-1在mRNA及蛋

18、白水平被顯著、持久沉默;Vasohibin-1基因的沉默影響hepG2的細胞周期，發(fā)生G2/M期阻滯，進而抑制了細胞的增殖，使細胞的生長速度減慢，凋亡增加，并能夠下調VEGF-A的表達下調，提示vasohibin-1可能通過調節(jié)VEGF-A的表達而參與肝癌細胞血管生成的調節(jié)，vasohibin-1有望成為肝癌基因治療的潛在靶點。
　　 3.成功篩選出能高效沉默vasohibin-1的慢病毒表達載體，該載體能有效感染hepG2細胞