1、局麻藥(LA)神經毒性反應的報道逐漸增多，已引起臨床高度重視，但目前LA引起神經毒性的確切機理尚未完全闡明。左旋布比卡因(LB)是一新型、長效酰胺類局麻藥，理化性質和麻醉效能與布比卡因相似，心血管系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)（CNS）毒性比布比卡因低，具有廣泛的應用前景，但其具體神經毒性機制尚不清楚。嚴重的LA神經毒性表現為細胞壞死，然而，越來越多的證據表明，凋亡已成為神經毒性發(fā)生的主要機制。
　　 人神經母細胞瘤是一種由新生兒的神經嵴衍

2、生的腫瘤，其為發(fā)生于兒童中最常見的實體瘤。但與其他的人類腫瘤相比，神經母細胞瘤也是自發(fā)衰退率最高的腫瘤之一。SH-SY5Y細胞源于人神經母細胞瘤細胞系SK-N.SH的克隆，因其具有正常神經細胞的生物學及分子生物學特性，多作為研究神經細胞毒性的模型。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族是由MAPK激酶激酶(MAPKKKs，MKKK)、MAPK激酶(MAPKKs, MKK)及其下游激酶MAPKs共同組成。MAPKs家族能夠對

3、多種細胞生長因子和促進有絲分裂物質作出反應，把細胞外信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔?，參與細胞基質、生長因子、炎癥反應等重要信號途徑，介導生長、發(fā)育、分裂分化、凋亡以及細胞間相互作用等多種細胞過程。氨基末端激酶(JNK)是MAPKs中三大激酶之一，大量研究顯示，JNK的激活在神經元凋亡過程中發(fā)揮重要作用。凋亡刺激促使MAPKKKs的激活，進而激活MKK，激活的MKK通過磷酸化其下游JNK，促進靶基因表達，從而誘導凋亡。MKK的激活為JNK

4、通路激活所必須，然而凋亡刺激如何促使MKK的介導并不完全清楚，已有研究報道JNK通路的激活參與布比卡因與羅哌卡因的神經毒性機制，布比卡因可刺激神經細胞內ROS（ROS）的爆發(fā)誘發(fā)凋亡，而ROS的產生可激活JNK通路，因此我們設想LB神經毒性機制與ROS與JNK通路有關。
　　 單磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，活化的AMPK可促進分解代謝，抑制合成代謝途徑，以增加三磷酸腺苷(ATP)的產生。研究表明，在

5、細胞中AMPK持續(xù)激活可引起ROS大量產生，從而導致細胞損傷和凋亡，然而AMPK激活ROS是否參與LB神經毒性機制，目前尚不清楚。
　　 在前期研究中已發(fā)現AMPK與LA，如布比卡因和羅哌卡因觸發(fā)細胞內ROS產生、釋放密切相關，然而ROS增多是否通過JNK通路誘發(fā)神經細胞凋亡仍未知。目前國內LB的臨床研究多集中于藥效學和藥代動力學研究，關于其神經毒性機制研究甚少。藉此我們推測，LB激活了AMPK通路，導致ROS產量增加，進而激活

6、MKKs，進一步激活下游JNK通路，導致SH-SY5Y細胞凋亡。
　　 綜上所述，本研究以不同濃度LB處理SH-SY5Y細胞24h，檢測細胞生存率，ROS平均熒光強度和凋亡比率，JNK蛋白及P-JNK蛋白;并應用了ROS抑制劑-N-乙酰半胱氨酸（NAC），通過轉染小干擾RNA分子(siRNA)，MKK4與MKK7siRNA，進而確定ROS激活JNK的作用靶點。為證實LB如何增加ROS，將實驗室內本研究組已經構建和鑒定的重組質粒p

7、EGFP-N1-AMPKα2轉染SH-SY5Y細胞，研究在AMPKα2高表達下，SH-SY5Y細胞受LB刺激后，與未轉染組及空載質粒組相比，細胞內ROS、細胞活力及細胞凋亡率及下游JNK蛋白的變化，以驗證上述推測。
　　 本研究旨在探索LB導致神經毒性的確切機制和原理，為臨床麻醉防治LA神經毒性提供理論依據。
　　 第1章 LB誘發(fā)ROS產生及SH-SY5Y細胞凋亡
　　 目的:探討LB誘發(fā)SH-SY5Y細胞產生

8、的ROS水平與細胞凋亡的關系。
　　 方法:SH-SY5Y細胞體外培養(yǎng)，細胞共分為12組，C組為對照組（未經藥物處理），L0.5～L2.5組(分別用0.5，1，1.5，2，2.5mM LB的培養(yǎng)液處理24h)，N組(NAC預處理1h)，N0.5～N2.5組(NAC預處理1h后，分別用0.5，1，1.5，2，2.5 mM LB的培養(yǎng)液處理24h)。采用CCK-8(Cell Counting Kit)法檢測細胞活力，流式細胞儀(fl

9、ow cytometry，FCM)檢測細胞內ROS平均熒光強度，Hochest33258檢測凋亡熒光和FCM檢測細胞凋亡率。
　　 統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（(x)±s）表示。細胞活力，細胞ROS水平，細胞凋亡率采用兩因素析因設計方差分析;單獨效應分析時，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Welch法和Dunnett's T

10、3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 (1)細胞活力經LB處理24h后細胞活力，細胞生存率呈現出劑量依賴性降低，L0.5～L2.5組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=907.093，P=0.000)，L2.5組細胞生存率最低，為（19.50±0.58）％;應用NAC預處理后，N～N2.5組細胞生存率均升高(F=14.346，P=0.000)。
　　 (2) Hoechst33258染色觀察到經過不同

11、濃度的LB處理后，SH-SY5Y細胞細胞核高度凝集顯現出強藍色熒光，尤以L2.0組強藍色熒光的細胞數目最多，當SH-SY5Y細胞經NAC預處理后，強藍色熒光細胞數目減少。
　　 (3)凋亡率 LB處理各組細胞凋亡率有統(tǒng)計學差異（F=205.123，P=0.000），其中L2.0組的調亡率最高，為（24.07±1.12）％;ROS抑制劑NAC預處理后，凋亡率均降低（F=25.047，P=0.004）。
　　 (4) ROS

12、平均熒光強度 LB處理各組細胞ROS平均熒光強度有統(tǒng)計學差異（F=64.098，P=0.000），其中L2.0組ROS平均熒光強度最高為2113.33±188.81;NAC預處理后，各組ROS平均熒光強度均降低(F=100.423，P=0.023)，其中N2.0組的熒光強度最高，NAC預處理后降低幅度最小(F=35.960，P=0.004)。
　　 結論:LB可致SH-SY5Y細胞呈劑量依賴性細胞生存率降低與ROS依賴性細胞凋亡

13、，ROS抑制劑NAC可減輕LB致細胞壞死及凋亡，LB為2mM時SH-SY5Y細胞凋亡率最高。
　　 第2章 LB通過ROS/MKK7/JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細胞凋亡
　　 第一部分 MKK4siRNA和MKK7siRNA對LB致細胞ROS及凋亡的影響
　　 目的:檢測SH-SY5Y細胞凋亡過程中MKK4與MKK7及ROS之間的聯系。
　　 方法:通過Q-PCR(Quantitative Polyme

14、rase chain reaction)篩選出轉染效率最高的MKK4siRNA和MKK7siRNA，并且檢測0，0.5，1，1.5，2，2.5 mMLB作用24h后，MKK4mRNA與MKK7mRNA的表達。將篩選出的MKK4siRNA轉染入細胞，LB濃度選擇細胞調亡率最高的2mM濃度（第一章實驗已證實）。細胞分組為:control組為對照組（未經轉染及藥物處理）;NAC組(單純5mMNAC處理1h); MKK4siRNA組（單純轉染M

15、KK4siRNA）;LB組（單純2mMLB處理24h）;LB+NAC組(5mM NAC預處理1h后2mM LB處理24h);LB+MKK4siRNA組(MKK4siRNA轉染后，2mM LB處理24h);LB+NAC+MKK4siRNA組（MKK4siRNA轉染后，5mM NAC預處理1h后2mMLB處理24h）。MKK7siRNA轉染分組同MKK4siRNA。FCM檢測各組細胞凋亡率和細胞內ROS平均熒光強度。
　　 統(tǒng)計學處

16、理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（(x)±s）表示。MKK4mRNA和MKK7mRNA水平，細胞ROS水平，細胞凋亡率采用單因素方差分析(one-way ANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Welch法和Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 (1) MKK4siRNA與MKK7siRNA的篩選分別篩選出沉默效果確切的MKK4siRN

17、A和MKK7siRNA，其中siRNA-MKK4-3組的MKK4mRNA表達量為0.06±0.10，siRNA-MKK7-1組的MKK7mRNA的表達量為0.63±0.01。后續(xù)實驗選擇siRNA-MKK4-3和siRNA-MKK7-1。
　　 (2) MKK4mRNA與MKK7mRNA的表達經不同濃度LB處理后MKK4mRNA的表達量各組之間無統(tǒng)計學差異（F=0.661，P=0.660），MKK7mRNA表達量各組之間有統(tǒng)計學

18、差異(F=1799.050，P=0.000)，LB=2mM時，MKK7mRNA表達量最高205.63±5.19。
　　 (3)細胞凋亡率與對照組調亡率相比，MKK4siRNA組無統(tǒng)計學差異(P=0.601)，LB組與LB+MKK4siRNA組相比，無統(tǒng)計學差異(P=1.000);與對照組凋亡率相比，MKK7siRNA組凋亡率降低(P=0.005)，與LB組相比，LB+MKK7siRNA組凋亡率降低(P=0.003)。
　　

19、 (4) ROS熒光強度與對照組ROS平均熒光強度相比，MKK4siRNA組無統(tǒng)計學差異（P=0.095），LB組與LB+MKK4siRNA組相比，無統(tǒng)計學差異(P=0.171);與對照組ROS平均熒光強度相比，MKK7siRNA組無統(tǒng)計學差異(P=1.000)，LB組與LB+MKK7siRNA組相比亦無統(tǒng)計學差異(P=1.000)，LB+NAC組低于LB組（P=0.015），LB+NAC+MKK7siRNA組低于LB組(P=0.02

20、4)。
　　 結論 LB可激活ROS/MKK7通路進而導致SH-SY5Y細胞的凋亡。
　　 第二部分 MKK4siRNA和MKK7siRNA對LB致JNK及P-JNK蛋白表達的影響
　　 目的:檢測SH-SY5Y細胞凋亡過程中ROS與MKK及JNK之間的聯系。
　　 方法:Western blot檢測不同濃度LB作用于細胞后JNK及P-JNK蛋白表達。MKK4siRNA轉染后細胞分組為:control組為

21、對照組（未經轉染及藥物處理）;NAC組（單純5mM NAC處理1h）;MKK4siRNA組(單純轉染MKK4siRNA); LB組(單純2mM LB處理24h); LB+NAC組(5mM NAC預處理1h后2mM LB處理24h);LB+MKK4siRNA組(MKK4siRNA轉染后，2mMLB處理24h); LB+NAC+MKK4siRNA組（MKK4siRNA轉染后，5mM NAC預處理1h后2mM LB處理24h）。Western

22、 blot檢測各組細胞P-JNK蛋白表達。MKK7siRNA轉染后分組同MKK4siRNA。
　　 統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（(x)±s）表示。JNK及P-JNK蛋白表達水平采用單因素方差分析(one-wayANOVA);多重比較采用LSD法，方差不齊時采用Welch法和Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 (1) LB處

23、理后JNK，P-JNK表達細胞經過不同濃度的LB處理24h，各組JNK蛋白表達有統(tǒng)計學差異（F=685.027，P=0.000），與對照組對比，LB為0.5，1，1.5，2，2.5mM時的JNK蛋白表達降低（P值均為0.000），與LB為2mM相比，LB為0.5，1，1.5mM時JNK蛋白表達較高（P值均為0.000），LB為2.5mM時JNK蛋白表達較低;各組P-JNK蛋白表達有統(tǒng)計學差異（F=1449.76，P=0.000），對照組

24、對比，LB為0.5，1，1.5，2，2.5mM時的P-JNK蛋白表達較高（P值均為0.000），與LB為2mM相比，LB=0.5，1，1.5mM時P-JNK蛋白表達較低（P值均為0.000），LB=2.5mM時P-JNK蛋白表達降低。綜上所述，LB=2mM時JNK磷酸化程度最高。
　　 (2) MKK4siRNA轉染后P-JNK表達MKK4siRNA轉染后，多重比較示，對照組與MKK4siRNA相比無統(tǒng)計學差異(P=1.000)

25、，LB組與LB+MKK4siRNA組相比無統(tǒng)計學差異(P=0.548)，LB+NAC組P-JNK蛋白表達水平低于LB組。
　　 (3) MKK7siRNA轉染后P-JNK表達 MKK7siRNA轉染后，各組之間有統(tǒng)計學差異（F=2209.632，P=0.000），多重比較示，對照組與MKK7siRNA相比有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，對照組P-JNK表達水平高于MKK7siRNA組，LB+MKK7siRNA組低于LB組(P=0

26、.000)，LB+NAC+MKK7siRNA組低于LB+NAC組(P=0.000)和LB+MKK7siRNA組(P=0.000)。
　　 結論:LB可通過ROS/MKK7/JNK通路進而引起SH-SY5Y細胞凋亡。
　　 第3章上調AMPKa2可促進LB通過ROS/MKK7JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細胞凋亡
　　 目的:探討過表達AMPKa2是否可介導LB通過ROS/MKK7/JNK通路誘發(fā)SH-SY5Y細胞凋

27、亡。
　　 方法:將質粒pEGFP-N1-AMPKα2和空載質粒pEGFP-N1分別轉染SH-SY5Y細胞株，細胞分組為:control組（未轉染任何質粒）;pEGFP-N1組（轉染空載質粒pEGFP-N1）;pEGFP-N1-AMPKα2組(轉染質粒pEGFP-N1-AMPKα2);LB組（未轉染任何質粒后2mMLB處理24h）;LB+pEGFP-N1-AMPKα2組(轉染質粒pEGFP-N1-AMPKα2后2mMLB處理24

28、h);LB+pEGFP-N1組(轉染質粒pEGFP-N1后2mMLB處理24h)。Western blot法檢測鑒定AMPKα2表達水平，CCK-8法檢測細胞活力，FCM檢測細胞凋亡率與細胞內ROS含量，Western blot法檢測鑒定P-JNK表達水平。
　　 統(tǒng)計學處理計量資料以均數±標準差（(x)±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。AMPKα2，P-JNK蛋白吸光度值，CCK-8法檢測細胞活力，ROS含量，細胞

29、凋亡率采用兩因素析因設計資料方差分析，組間比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett's T3法（方差不齊）。P＜0.05有統(tǒng)計學差異。
　　 結果:轉染重組質粒pEGFP-N1-AMPKα2的SH-SY5Y細胞組，其AMPKα2表達上調;2mM LB處理后，與空載質粒pEGFP-N1細胞組及未轉染質粒的細胞組相比，細胞內ROS含量提高，細胞活力降低，細胞凋亡率增多，P-JNK蛋白水平升高;而空載質粒pEGFP-N1細胞組與未轉