1、脊髓損傷（Spinal cord injury, SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，是人類致殘的重要原因之一，全球每年新增140000例SCI患者，我國2002年北京地區(qū)SCI發(fā)生率為60/百萬人口。SCI可導(dǎo)致?lián)p傷平面以下不同程度癱瘓，而且SCI主要發(fā)生在青壯年人群中，從SCI中存活下來的患者其生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，給家庭、社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。隨著近年我國工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的改變及醫(yī)

2、療搶救網(wǎng)絡(luò)建設(shè)的相對(duì)滯后，我國面臨SCI救治的現(xiàn)狀十分嚴(yán)峻。鑒于SCI的高致殘率及產(chǎn)生的嚴(yán)重社會(huì)負(fù)擔(dān)，尋求SCI新的有效治療方法成為目前研究熱點(diǎn)。SCI后病理生理變化與發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜。首先，脊髓由于機(jī)械性外傷導(dǎo)致組織撕裂、扭曲、壓迫等，伴隨著脊髓局部血循環(huán)障礙，出血、局部缺血、水腫、炎癥等進(jìn)一步使脊髓細(xì)胞死亡。脊髓再生微環(huán)境惡化，局部軸突抑制因子產(chǎn)生，局部神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變，尤其是鈣超載使脊髓白質(zhì)中的軸突變性，這些變化持續(xù)數(shù)天，稱之為初

3、次損傷;損傷不止于此，初次損傷可以激活體內(nèi)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)改變，其中一個(gè)重要的變化是星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，分泌產(chǎn)生致密的膠質(zhì)瘢痕，抑制軸突再生。與此同時(shí)，由于損傷導(dǎo)致血腦屏障破壞，外周血的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤至損傷局部，與脊髓內(nèi)部的小膠質(zhì)細(xì)胞協(xié)同進(jìn)一步破壞脊髓再生環(huán)境，抑制軸突再生。為減輕SCI給患者帶來的傷害，學(xué)者們探討了諸多SCI的治療方法，包括:藥物治療、神經(jīng)營養(yǎng)因子、基因治療和細(xì)胞移植等。隨著干細(xì)胞領(lǐng)域研究的深入，干細(xì)胞移

4、植被證實(shí)是修復(fù)SCI十分有希望的手段。已有多種類型的干細(xì)胞被嘗試應(yīng)用于不同動(dòng)物SCI模型甚至Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)中。理論上，由囊胚的內(nèi)細(xì)胞層分離而來的胚胎干細(xì)胞，可跨胚層分化，具有方向分化潛能(pluripotency)，是移植的最佳選擇，但由于受倫理學(xué)限制及潛在的致畸性與致瘤性，其應(yīng)用前景受限;CNS干細(xì)胞分化能力強(qiáng)，但在神經(jīng)發(fā)育過程中數(shù)量逐漸減少而且傳代后細(xì)胞易老化，同時(shí)也受倫理學(xué)限制，影響其臨床應(yīng)用;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞由于其技術(shù)要求較高，

5、難以獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞;雪旺細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞移植療效較好，但取材難度大，難以擴(kuò)增出足夠的細(xì)胞量，不適于臨床應(yīng)用。成體間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)來源廣泛，取材方便，不受倫理學(xué)限制，并可經(jīng)過改造，成為一個(gè)良好的載體，有望成為臨床移植修復(fù)SCI良好的細(xì)胞來源。
　　 自從發(fā)現(xiàn)MSCs后，人們即嘗試移植MSCs修復(fù)CNS損傷疾病模型，其中MSCs移植治療SCI動(dòng)物模型已近二十年。大量文獻(xiàn)報(bào)道取得

6、部分令人鼓舞的結(jié)果，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，MSCs移植修復(fù)仍無突破性成果。究其原因，除SCI本身病理生理變化極端復(fù)雜，單純MSCs移植難以對(duì)抗所有的病理變化之外，結(jié)合參考文獻(xiàn)，我們認(rèn)為還存在以下原因:(1) MSCs修復(fù)SCI的機(jī)制尚未闡釋清楚。誠然，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MSCs移植修復(fù)SCI療效肯定，臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗(yàn)進(jìn)一步提示MSCs可用于移植治療SCI。但其修復(fù)機(jī)制是細(xì)胞替代？營養(yǎng)因子？抗凋亡？抗炎癥？目前尚無確切回答;(2) MSCs的來源問題。

7、MSCs最早是從骨髓中分離獲取，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC)，目前關(guān)于MSCs移植修復(fù)各種疾病模型大都也是以BMSC完成的。但培養(yǎng)BMSC需抽取大量的骨髓（約100ml），有一定的風(fēng)險(xiǎn)，包括感染、疼痛等，而且BMSC傳至7-8代后細(xì)胞易老化，其分泌營養(yǎng)因子功能下降。究竟哪一種MSCs是最適合移植修復(fù)SCI，目前仍無可靠的數(shù)據(jù)供參考，這也是本研究考慮的重

8、點(diǎn)。(3)MSCs的跨胚層分化問題。MSCs作為中胚層來源的細(xì)胞，不但能骨、軟骨、脂肪等細(xì)胞轉(zhuǎn)化，已有研究報(bào)道，MSCs在體內(nèi)及體外均擁有向神經(jīng)外胚層細(xì)胞（神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等）轉(zhuǎn)化的能力。是否有必要在移植前對(duì)MSCs進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)，目前仍存在爭議。鑒于分離培養(yǎng)BMSC面臨如上所述的困難，尋求MSCs另一種可靠的來源就顯得格外重要。為此，人們進(jìn)行了廣泛的探索。包括:臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等

9、。在眾多的MSCs中，由于脂肪組織來源廣泛、易于獲取、無倫理學(xué)限制，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose derived mesenchymal stem cell，ADSC）尤為引人注意。ADSC移植治療不同器官損傷已經(jīng)有不少文獻(xiàn)報(bào)道，并取得了一些令人滿意的結(jié)果。但關(guān)于ADSC與BMSC在移植修復(fù)SCI中有何不同效果，ADSC是否能取得像BMSC一樣的或者更好的效果，目前尚無全面的數(shù)據(jù)可參考。本研究擬在以往研究的基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)

10、，力爭較全面的比較分析ADSC與BMSC在修復(fù)大鼠SCI中的異同點(diǎn)，并試圖分析產(chǎn)生這些異同點(diǎn)的機(jī)制，為臨床應(yīng)用MSCs移植修復(fù)SCI提供理論與實(shí)驗(yàn)支持。目前國外已有兩個(gè)研究分別比較了ADSC與BMSC在修復(fù)大鼠心肌梗塞與缺血性腦卒中的不同療效，這些研究所用種子細(xì)胞均是鼠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。目前采用人來源的干細(xì)胞移植治療大鼠SCI的報(bào)道越來越多，比如人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞、人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等。另外，從將

11、來臨床應(yīng)用角度考慮，人來源間充質(zhì)干細(xì)胞移植更符合臨床應(yīng)用實(shí)際?；诒阌谂c以往研究數(shù)據(jù)比較和臨床實(shí)際考慮，本研究所用間充質(zhì)干細(xì)胞均為人來源的ADSC(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，hADSC)與人來源的BMSC(human bone-derived mesenchymal stem cell，hBDSC)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)

12、胞與人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)性狀的比較研究。
　　 目的：分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSC)與人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSC)，充分比較兩者的生物學(xué)特征。
　　 方法：收集5名在我科行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的成年志愿者（年齡:45-60歲，無其他基礎(chǔ)疾?。?，術(shù)前簽署知情同意書。術(shù)中分別收集其皮下脂肪組織與骨髓組織。采用梯度密度離心法分離培養(yǎng)hBMSC;采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)hADSC。為減小實(shí)驗(yàn)誤差，細(xì)胞培養(yǎng)過

13、程中所用的培養(yǎng)基、胰酶、血清等兩種細(xì)胞均一致。細(xì)胞長至80％滿后胰酶消化傳代。取生長良好的第4代細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞表型分析、細(xì)胞免疫熒光法鑒定表面蛋白、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測營養(yǎng)因子mRNA表達(dá)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)法檢測細(xì)胞分泌營養(yǎng)因子功能。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（(x)±s）來表示，并應(yīng)用

14、SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用兩樣本t檢驗(yàn)及兩因素析因分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果：成功分離培養(yǎng)兩種間充質(zhì)干細(xì)胞。形態(tài)上，hADSC與hBMSC類似，均成紡錘形，具備典型的MSCs的形態(tài)學(xué)特征;流式檢測結(jié)果顯示hADSC與hBMSC均高表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物CD90(99.47％與99.31％)，CD105(97.98％與98.46％)和粘附分子CD29(99.23％與99.31％)，CD44(98

15、.37％與98.26％);低表達(dá)造血系細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34(0.05％與1.45％)，血管內(nèi)皮性抗原CD45(0.91％與0.64％)，單核細(xì)胞抗原CD11b(0.02％與1.76％)，和人類白細(xì)胞抗原HLA-DR(0.17％與1.45％)。細(xì)胞熒光證實(shí)，兩種細(xì)胞均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)、層粘連蛋白（laminin）、纖連蛋白（fibronectin）與干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白(nestin);hADSC與hBM

16、SC有絲分裂標(biāo)志物Ki67表達(dá)率分別為57.22％±5.76％、46.02±3.18％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.381，P=0.000);傳代后發(fā)現(xiàn)，hBMSC傳代至第7代左右即出現(xiàn)老化現(xiàn)象，增殖能力下降，而hADSC可傳代至30代無明顯變化。hADSC倍增時(shí)間明顯短于hBMSC，CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hADSC增殖速度顯著快于hBMSC(p＜0.05)。RT-PRC證實(shí)hADSC表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-deriv

17、ed neurotrophic factor，BDNF)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelial cell growth factor，VEGF)與肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF) mRNA水平顯著高于hBMSC(p＜0.05); ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，hADSC分泌BDNF、VEGF濃度高于hBMSC(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：本研究通過取自愿者皮下脂

18、肪與骨髓，成功建立了分離培養(yǎng)hBMSC與hADSC體系。與hADSC比較，hBMSC增殖速度較慢、易老化、分泌營養(yǎng)因子能力弱，脂肪組織可能更適合用于分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 第二部分：入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的研究。
　　 目的：基于上一章的研究基礎(chǔ)，制備背側(cè)半切大鼠脊髓損傷模型，分別移植hADSC和hBSMC，比較兩者對(duì)SCI大鼠的修復(fù)效果，并分析其機(jī)制。
　　 方法：取第

19、四代hADSC與hBMSC，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為105/μl，備用。制備背側(cè)半切脊髓損傷模型（以中央導(dǎo)水管為標(biāo)準(zhǔn)）。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成三組:Ⅰ:損傷對(duì)照組，SCI后注射PBS;Ⅱ:hADSC組，SCI后移植hADSC;Ⅲ:hBMSC組，SCI后移植hBMSC。以損傷點(diǎn)頭尾兩側(cè)各2mm為細(xì)胞移植點(diǎn)，將2×105個(gè)細(xì)胞移植到相應(yīng)組別大鼠脊髓內(nèi)。移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。研究比較各組動(dòng)物BDNF蛋白表達(dá)水平、運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)(Basso-B

20、eattie-Bresnahan，BBB)、組織形態(tài)學(xué)修復(fù)、炎癥與凋亡反應(yīng)、移植干細(xì)胞存活分化及神經(jīng)軸突再生等。為比較各組大鼠皮質(zhì)脊髓束再生情況，于移植術(shù)后第28天每組隨機(jī)選取大鼠5只，在大腦感覺運(yùn)動(dòng)皮層（前囟前2mm，中線旁2mm以內(nèi)）注射順行追蹤劑生物素葡聚糖胺(Biotinylated Dextran Amine，BDA)，2周后處死大鼠進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（(x)±S）表示，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行

21、統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單向方差分析(one-way ANOVA)及兩因素析因分析(two-way ANOVA)。方差分析顯著而且方差檢驗(yàn)齊的情況下，多重比較采用Bonferroni法;方差顯著而方差不齊的情況下，采用Welch法校正F檢驗(yàn)及Dunnett T3多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果：⑴細(xì)胞存活、遷移、分化情況:細(xì)胞移植后一周，大鼠脊髓內(nèi)可見大量移植干細(xì)胞存活，定量分析發(fā)現(xiàn)hBMSC組與hADSC

22、組存活率為33.87％±4.45％，hADSC組為35.59％±5.38％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.427，P=0.692)。至第四周時(shí)，大部分移植細(xì)胞均死亡，hBMSC組與hADSC組存活率分別為0.87％±0.25％和0.95％±0.33％(t=-0.337，P=0.753);兩種細(xì)胞的遷移方式類似，均能從移植點(diǎn)向損傷邊緣遷移;兩種細(xì)胞在宿主體內(nèi)的分化情況十分類似，本研究未觀察到移植干細(xì)胞分化為β-tubulin陽性神經(jīng)元，NF

23、200陽性神經(jīng)絲，GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞，CNPase陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞與S100陽性雪旺細(xì)胞;兩種細(xì)胞的宿主體內(nèi)的分裂狀況也十分相似，絕大部分移植的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)不再繼續(xù)表達(dá)Ki67，未見聚集分布的Ki67陽性細(xì)胞。⑵運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況:脊髓損傷后所有動(dòng)物BBB評(píng)分均為0，此后逐漸恢復(fù)，一周時(shí)BBB評(píng)分恢復(fù)至4-5分，在前2周各組大鼠BBB評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第2周開始，hADSC組大鼠BBB評(píng)分顯著高于hBMSC組與損傷對(duì)照組，

24、并一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，術(shù)后4周hADSC組、hBMSC組與對(duì)照組大鼠BBB評(píng)分分別為12.5±0.5、11.2±0.6與9.2±0.3。⑶軸突再生情況:單向方差分析顯示，SCI后第4周，各組大鼠損傷周邊NF200陽性纖維數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=115.816，P=0.000)，hADSCs組與hBMSCs組顯著高于損傷對(duì)照組，而且hADSCs組的數(shù)目最多。各組動(dòng)物5-HT陽性纖維數(shù)目再生情況與NF200類似。對(duì)于皮質(zhì)脊髓束纖維，在損傷頭

25、側(cè)，各組均可見大量的BDA陽性纖維，而在損傷點(diǎn)尾端，各組均無再生的BDA陽性皮質(zhì)脊髓束纖維。⑷BDNF表達(dá)情況:Westernblot結(jié)果表明，MSCs移植組大鼠術(shù)后第3天BDNF蛋白表達(dá)水平明顯高于損傷對(duì)照組，而且以hADSC組表達(dá)最高(P＜0.05);ELISA檢測進(jìn)一步證實(shí)移植術(shù)后第3天、第7天hADSC組大鼠脊髓BDNF濃度顯著高于hBMSC組與損傷對(duì)照組(P＜0.05)。⑸炎癥與凋亡:脊髓損傷后，由于炎癥與凋亡導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡

26、，形成不利于神經(jīng)再生的脊髓內(nèi)環(huán)境。MSCs移植可減輕損傷周邊炎癥與凋亡反應(yīng)。析因方差分析顯示，不同組動(dòng)物ED-1+陽性面積有顯著差異(F組別=622.460，P組別=0.000)，時(shí)間對(duì)動(dòng)物ED-1+陽性面積有顯著影響(F時(shí)間=240.320，P時(shí)間=0.000)，時(shí)間與分組存在交互效應(yīng)（F時(shí)間×分組=19.025，P時(shí)間×分組=0.000）。經(jīng)單因素ANOVA分析，在損傷后1周及4周，MSCs移植顯著下調(diào)損傷周邊ED-1陽性炎癥細(xì)胞數(shù)

27、目，三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以hADSC組下降的最明顯(P＜0.05)。凋亡分析結(jié)果顯示，在細(xì)胞移植后1周hADSC組與hBMSC組、損傷對(duì)照組比較，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：hADSC移植到SCI大鼠體內(nèi)后未見腫瘤形成等不良反應(yīng)，hADSC促進(jìn)SCI大鼠功能恢復(fù)的效果優(yōu)于hBMSC，其機(jī)制可能與提高脊髓內(nèi)BDNF表達(dá)水平、下調(diào)炎癥與凋亡、促進(jìn)軸突再生有關(guān)。hADSC可替代hBMS