1、選題背景:
　　 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，多種分子生物學(xué)技術(shù)如PCR指紋分型，擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性，核糖體rDNA序列分析，多位點序列分型等相繼用于隱球菌的分子流行病學(xué)及遺傳多態(tài)性研究，極大地促進(jìn)了人類對新生隱球菌遺傳多態(tài)性的認(rèn)識，增強(qiáng)了尋找致病線索的信心。通過分子生物學(xué)基因分型的方法了解各地流行的隱球菌基因型，對明確隱球菌的發(fā)病機(jī)制及流行趨勢有著深遠(yuǎn)的意義。
　　 采用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)分析方法對臨床隱球菌

2、感染患者體液中分離出的菌株進(jìn)行基因分型，有助于了解我國臨床隱球菌的分子流行病學(xué)特征并監(jiān)測各基因型的變遷情況。結(jié)合隱球菌臨床分離株對常見抗真菌藥物的敏感性和臨床患者的臨床表現(xiàn)、治療效果及預(yù)后，以揭示基因型、體外藥敏實驗和臨床治療之間的關(guān)聯(lián)。本課題分析了61株隱球菌臨床分離株的基因型和對兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性，分析了基因型和體外藥敏的關(guān)聯(lián)。
　　 另外，如何更早更準(zhǔn)確的明確隱球菌病的診斷對于臨床早期開

3、展抗真菌治療和改善臨床預(yù)后至今仍是目前臨床診療亟需解決的眾多問題之一，本課題還嘗試結(jié)合隱球菌特異性基因和目前已有的分子技術(shù)方法中，尋求新的更快速的診斷方法。
　　 研究目的:
　　 1.分析1993-2009年分離自我國臨床感染患者的61株隱球菌的基因型組成;
　　 2.觀察61株隱球菌臨床株對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的體外藥物敏感性;
　　 3.分析不同種屬、不同基因型的隱球菌對藥物敏感性

4、的差異;
　　 4.基于隱球菌H99的IGS1基因序列，結(jié)合LAMP技術(shù)，快速特異的診斷隱球菌感染。
　　 研究方法:
　　 1.多位點基因序列分析及基因分型
　　 多位點基因序列分析:對61株隱球菌臨床株的IGS1和CAP59基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序、序列分析;將各隱球菌臨床株鑒定至基因亞型。
　　 2.觀察隱球菌臨床株對常見抗真菌藥物的敏感性
　　 用美國CLSI的M27A2微量稀釋法

5、對61株隱球菌臨床株進(jìn)行常見抗真菌藥物兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的藥敏實驗。
　　 3.比較不同基因型的隱球菌臨床株對常見抗真菌藥物敏感性的差異
　　 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測隱球菌
　　 基于新生隱球菌H99的IGS1序列，利用LAMP（環(huán)等溫介導(dǎo)擴(kuò)增）方法，通過檢測隱球菌不同基因型的菌株和其他常見真菌驗證其特異性，根據(jù)可檢測出的最小DNA濃度判斷其敏感性。
　　 結(jié)果:

6、r>　　 1.多位點基因序列分析及基因分型
　　 分離自臨床感染患者的61株隱球菌臨床株中，45株(73.77％)為VNⅠ基因型菌株;5株(8.20％)為VNⅡ基因型菌株;2株(3.28％)為VNⅢ基因型菌株;;14株(14.75％)為VGⅠ基因型。
　　 IGS1基因結(jié)合CAP59基因序列分析可以明確的將各臨床株鑒定至基因型水平。
　　 2.觀察隱球菌臨床株對常見抗真菌藥物的敏感性
　　 61株隱球菌

7、臨床分離株對兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，最小抑菌濃度范圍分別為0.0625～1μg/ml，0.313-4μg/ml，0.125～16μg/ml0.125～8μg/ml,MIC90分別為1μg/ml,0.25μ g/ml,4μ g/ml,4μ g/ml。
　　 3.不同基因型的隱球菌臨床株對常見抗真菌藥物敏感性的差異
　　 (1)47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對氟康唑的MIC濃度為0.125

8、-4μ g/Ml，其幾何平均數(shù)為1.1589μ g/Ml;而14株來自HIV感染患者的臨床分離株對氟康唑MIC濃度為0.5-16μ g/Ml，其幾何平均值為3.1228μ g/Ml;其差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001)。
　　 (2)47株從非HIV感染患者體液中分離得到的菌株對氟胞嘧啶的MIC濃度為0.125-4μ g/Ml，其幾何平均數(shù)為1.4038μ g/Ml;而14株來自HIV感染患者的臨床分離株對氟康唑MIC濃度為0

9、.5-8μ g/Ml，其幾何平均值為2.9720μ g/Ml;其差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 (3)新生隱球菌對兩性霉素B，伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC濃度分別為0.0625-1μ g/Ml，0.313-4μ g/Ml，0.125-16μ g/Ml.0.125-8μ g/Ml。格特隱球菌對這四種抗真菌藥物 MIC濃度為0.125-1μ g/Ml，0.0313-0.5μ g/Ml，0.5-4μ g/Ml，0.

10、5-4μ g/Ml。從種間差異分析，新生隱球菌和格特隱球菌對于這四種抗真菌藥物的差異不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 (4)從基因型分類角度，基因型VNⅠ對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶MIC幾何平均值分別為0.5156μ g/Ml，0.1122μ g/Ml，1.3608μ g/Ml，1.6371μ g/Ml;而基因型VGⅠ則分別為0.6300μ g/Ml，0.1072μ g/Ml，1.8517μ g/Ml，1.8517μ g/

11、Ml。這兩種基因型的隱球菌對兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶的MIC均無統(tǒng)計學(xué)差異。由于在基因型VNⅠ的菌株中有部分菌株來自于HIV感染陽性的患者，為了盡可能減少干擾因素，我們將基因型VNⅠ菌株中來自于HIV感染患者的菌株去除后，再次與基因型VGⅠ菌株分別就兩性霉素B、伊曲康唑、氟康唑、氟胞嘧啶再次做Student's比較，結(jié)果依然無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 4，構(gòu)建新的快速、特異、敏感的方法以檢測隱球菌
　　 基于IG

12、S1序列設(shè)計的引物在LAMP反應(yīng)體系具有良好的特異性，除了新生隱球菌和格特隱球菌八個基因型出現(xiàn)陽性結(jié)果外，其他菌株包括勞倫特隱球菌、淺白隱球菌、淺黃隱球菌、土生隱球菌、指甲隱球菌、瘦弱隱球菌、斯金納隱球菌、念珠菌屬中的白念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌、毛孢子菌等均未出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)。
　　 基于新生隱球菌H99的核糖體內(nèi)基因間隔區(qū)IGS序列的LAMP敏感程度可以達(dá)到0.002fg（即10-6ng）。

13、>　　 結(jié)論:
　　 1.分離自我國臨床患者的隱球菌臨床株以VNⅠ基因型菌株為主;分離自AIDS患者的臨床株亦以VNⅠ基因型菌株為主，2.我國的隱球菌臨床株絕大部分對常見抗真菌藥兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶均敏感，存在個別菌株對兩性霉素B的敏感性下降，可能與臨床上治療接觸該藥有關(guān)系，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究探討;3隱球菌各基因型對這四種抗真菌藥物的體外藥敏無顯著差異;4，來源于HIV陰性患者的臨床株比來源HIV陽性的菌