1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)作為一種傳統(tǒng)中藥主要應用于臨床對心血管系統(tǒng)疾病的治療。丹參酮作為其主要有效成分之一具有消炎、抑菌、抗氧化及抗癌等多種生物活性。然而由于丹參野生資源日益減少,栽培丹參生長周期較長,品質嚴重退化,藥用活性成分含量低遠不能滿足市場要求等問題,使得如何使丹參這一原料藥材的供應在數(shù)量和質量上能更好地滿足臨床應用的需求成了一個研究熱點。
　　 本課題采用基因工程手段,從分子水平上對丹

2、參酮生物合成途徑進行改造,首次將關鍵酶基因SmDXS2遺傳轉化丹參,利用構建1-脫氧-D-木酮糖-5磷酸(DXP)途徑中第一個關鍵酶-1-脫氧-D-木酮糖合成酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase,DXS)基因的一個成員SmDXS2的過量表達載體(pCAMBIA1304++SmDXS2)以及抑制表達載體(pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2),通過農桿菌C58C1介導遺傳轉化丹參,將

3、SmDXS2和Anti-SmDXS2基因轉入丹參,并獲得轉基因毛狀根。進而分析SmDXS2在陽性轉基因毛狀根株系中的表達變化情況,同時測定陽性轉基因毛狀根株系的丹參酮含量,從而研究關鍵酶基因SmDXS2在丹參酮合成代謝通路中所發(fā)揮的作用。所取得的結果如下:
　　 1.載體構建和工程菌制備:在本實驗室前期工作基礎之上,成功構建了植物表達載體pCAMBIA1304++SmDXS2和pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2。用

4、凍融法將兩個表達載體質粒分別導入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1中,PCR檢測結果說明成功獲得了用于遺傳轉化的C58C1工程菌；
　　 2.丹參遺傳轉化:用農桿菌介導法轉化丹參葉片,結果分別獲得SmDXS2陽性毛狀根克隆46個和Anti-SmDXS2陽性克隆34個；
　　 3.基因整合:PCR檢測中,分別在植物表達載體上組成型啟動子CaMV35S的內部及插入基因的內部設計上游及下游特

5、異性引物進行DNA的PCR擴增,結果證實獲得18個SmDXS2陽性克隆,陽性率為39.1％,14個Anti-SmDXS2陽性克隆,陽性率為41.2％；
　　 4.轉錄水平表達:半定量RT-PCR結果顯示,SmDXS2在不同克隆中的表達水平不同,且SmDXS2陽性克隆的表達量明顯高于Anti-SmDXS2陽性克?。?br>　　 5.丹參酮含量:利用HPLC測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮含量,結果表明,過量表達SmDXS2的克隆中丹