1、Toll樣受體(toll-likereceptors,TLRs)是免疫細胞識別病原體分子的一類重要受體,也在心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元等多種細胞表達,參與細胞應激和炎癥反應等生理病理過程。已被克隆的人類TLRs有11種亞型,被報道在鼠類心肌細胞表達的包括TLR2/3/4/5/7/9亞型。HSP60(heatshockprotein60)是HSPs家族的成員之一,生理狀態(tài)下主要位于線粒體內(nèi)(約70-80％),小部分位于胞漿。文獻報道,

2、外源性HSP60(胞外HSP60)能夠激活巨噬細胞和成纖維細胞的TLR2和TLR4受體,導致腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、白介素(interleukin,IL)等致炎因子產(chǎn)生,但胞外HSP60是否影響TLR2和TLR4受體表達未見報道。我們前期報道,在心肌缺血大鼠模型,HSP60異常出現(xiàn)在血清中,即出現(xiàn)胞外HSP60(Linetal,AJP,2007;293:H2238-47)。我們預實驗發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)的

3、大鼠H9c2心肌細胞系,外源性HSP60能夠上調(diào)TLR2和TLR4表達,而缺血心肌TLR2和TLR4表達也上調(diào)。因此,我們推測,心肌缺血時,異常出現(xiàn)在血液中的HSP60(胞外HSP60)很可能不僅作為配體激活心肌細胞的TLR2和/或TLR4,而且能夠上調(diào)心肌表達TLR2和TLR4。為證明這一假設,本課題在正常培養(yǎng)的H9c2心肌細胞,研究了外源性HSP60上調(diào)TLR2/4表達的作用及信號機制;并且,在H9c2心肌細胞模擬缺血模型和整體大鼠

4、心肌缺血模型,研究了內(nèi)源性胞外HSP60上調(diào)TLR2/4表達的作用及信號機制。
　　研究方法
　　在大鼠H9c2心肌細胞模型中,給予外源性HSP60或模擬缺血(無血清+低糖+1%低氧),ELISA法檢測培液上清HSP60含量檢測模擬缺血是否引起HSP60出胞;通過real-timePCR和Westernblot法檢測TLR2/4表達;通過特異性阻斷HSP60信號通路中的主要信號分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF

5、-κB”,研究HSP60上調(diào)TLR2/4表達的信號機制。
　　在整體大鼠心肌缺血模型中,結(jié)扎冠狀動脈左前降支(LAD)造成心肌缺血以及靜脈注射HSP60抗體來中和封閉血漿中的HSP60后,通過real-timePCR和Westernblot法檢測心肌TLR2/4表達;ELISA法和Westernblot法檢測血漿HSP60。
　　研究結(jié)果
　　1.在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞系,外源性HSP60通過TLR4-MyD88

6、-JNK/NFκB信號通路介導上調(diào)TLR2和TLR4表達:外源性HSP601μg/mL使得TLR2和TLR4mRNA水平和蛋白表達量均顯著上調(diào);特異性阻斷HSP60信號通路中的主要信號分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”結(jié)果表明,TLR4siRNA、MyD88抑制性多肽(InhiMyD88)、JNK抑制劑SP600125、NF-κB抑制劑PDTC四種干預能夠顯著抑制外源性HSP60引起的TLR2和TLR4表達上調(diào),而

7、TLR2siRNA和p38抑制劑SB203580無顯著效應,表明HSP60上調(diào)TLR2/4表達的效應由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介導。TLR4siRNA不僅抑制TLR4表達,而且顯著抑制HSP60引起的TLR2/4上調(diào),TLR2siRNA僅僅抑制TLR2表達,不影響HSP60引起的TLR2/4上調(diào)。
　　2.在模擬缺血培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞,HSP60出現(xiàn)在胞外,并且經(jīng)TLR4-MyD88-JNK/NFκB通

8、路參與介導模擬缺血所致TLR2和TLR4表達上調(diào):在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞,模擬缺血引起培液上清中出現(xiàn)HSP60,即HSP60出現(xiàn)在胞外;同時,模擬缺血引起TLR2/4表達上調(diào),用抗體特異性封閉胞外HSP60或者阻斷信號分子TLR4、MyD88、JNK和NF-κB能夠顯著抑制該效應,表明“胞外HSP60-TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路”參與介導模擬缺血所致TLR2/4表達上調(diào)。
　　3.在整體大鼠心肌缺血模型,HS

9、P60異常出現(xiàn)在血漿中,并且參與介導缺血所致心肌TLR2和TLR4表達上調(diào):在冠狀動脈左前降支(LAD)結(jié)扎所致大鼠急性心肌缺血模型,我們用Westernblot和ELISA法均檢測到LAD結(jié)扎4h后血清中出現(xiàn)HSP60,而假手術(shù)組(sham)基本檢測不到,表明心肌缺血引起HSP60異常出現(xiàn)在胞外;LAD結(jié)扎后4h,Westernblot法檢測到左室前壁、左室后壁、右室以及室間隔中TLR2和TLR4受體表達水平均顯著高于假手術(shù)組(sha

10、m),表明LAD結(jié)扎后,全心臟TLR2和TLR4表達上調(diào);用HSP60抗體中和血清中的HSP60,觀察到能夠顯著抑制心肌缺血引起的TLR2和TLR4表達上調(diào),而對照抗體IgG沒有抑制效應,表明胞外HSP60參與介導心肌缺血所致TLR2/4表達上調(diào)。
　　結(jié)論
　　1.在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞系,外源性HSP60上調(diào)TLR2和TLR4表達,該效應由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介導。
　　2.在模擬缺血

11、培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞,HSP60出現(xiàn)在胞外,并且經(jīng)TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路參與介導模擬缺血所致TLR2和TLR4表達上調(diào)。
　　3.在整體大鼠心肌缺血模型,HSP60異常出現(xiàn)在血漿中,并且參與介導缺血所致心肌TLR2和TLR4表達上調(diào)。
　　上述研究表明,心肌缺血時HSP60異常出現(xiàn)在胞外,胞外HSP60通過TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路使得心肌細胞TLR2/4表達上調(diào),該作用是缺血心肌T