1、第一部分Tim-3及Galectin-9在肝癌中的表達及臨床意義
　　目的：檢測Tim-3及Galectin-9在肝癌中的表達,探討Tim-3在肝癌中的表達與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。
　　方法：收集38例臨床新鮮肝癌組織標本,其中包括30例HBV+,8例HBV-,采用流式細胞檢測T細胞上Tim-3及Galectin-9的表達,免疫組化化學(xué)染色法檢測組織中Tim-3的表達,實時定量PCR檢測其mRNA的表達。同時收集了2007-2

2、010年間99例HBV+的肝癌組織標本,比較Tim-3的表達與臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)Galectin-9在肝癌微環(huán)境中主要表達在Kuffer細胞上,陽性率為40％,而對于HBV+及HBV-的肝癌患者中Galectin-9在Kuffer細胞上的表達率有顯著差異。Tim-3在肝癌組織中的表達高于癌旁組織,且在HBV+肝癌患者中的表達高于HBV-患者,同時在CD4+T細胞中的表達稍高于CD8+T細胞,相應(yīng)的Tim-

3、3的mRNA的相對表達量呈同步改變。生存分析發(fā)現(xiàn),Tim-3表達率較高的患者3年術(shù)后生存率明顯短于表達率較低的患者。
　　結(jié)論：Tim-3以及Galectin-9在腫瘤組織中明顯高表達,且Tim-3的表達與有無HBV感染有關(guān),Tim-3的高表達提示較差的預(yù)后,因此,Tim-3可以作為一個評估肝癌預(yù)后的指標。
　　第二部分Tim-3/Galectin-9通路對CD4+T細胞功能的影響
　　目的：研究Tim-3/Galec

4、tin-9通路激活以及被阻斷后肝癌微環(huán)境中CD4+T細胞功能改變。
　　方法：提取人新鮮肝癌組織中侵潤的淋巴細胞,用流式細胞技術(shù)分析免疫細胞的表型及細胞因子,同時分選Tim-3+CD4+T細胞與Kuffer細胞共培養(yǎng),利用Tim-3阻斷性抗體抑制Tim-3/Galectin-9通路的激活,再用流式細胞技術(shù)分析Tim-3+CD4+T細胞所表達的細胞因子的改變,同時用Elispot檢測其IFN-γ的表達變化,并且用CSFE標記實驗鼠與

5、對照組的Tim-3+CD4+T細胞,觀察其增殖改變,最后用實時定量PCR檢測細胞周期調(diào)控基因P16、P21、CDK7、CDC2等表達,判斷其細胞周期改變。
　　結(jié)果：肝癌患者微環(huán)境中的Tim-3+CD4+T細胞的功能呈受抑制狀態(tài),其分泌的IFN-γ、IL-2明顯少于Tim-3-CD4+T細胞,且反應(yīng)其細胞活性的標志HLA-DR、Ki-67也明顯減少,但使用Tim-3阻斷性抗體后,這些細胞因子及表面標志的表達水平上調(diào),提示了這群細胞