1、血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管病變的關(guān)鍵部位，自Ross提出“炎癥反應(yīng)”學(xué)說后，內(nèi)皮凋亡逐漸被認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)。在AS發(fā)生早期，AS易發(fā)區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有凋亡現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可加速AS的進(jìn)程釋放各種促AS因子，而后者又可進(jìn)一步加重AS進(jìn)展，形成惡性循環(huán)。越來越多的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖能夠介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂和凋亡。其中，高血糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，不僅造成血管壁通透性增加，也使血管內(nèi)

2、皮喪失正常的調(diào)節(jié)舒縮、抗粘附等功能，被認(rèn)為是糖尿病加速動(dòng)脈粥樣硬化引起大血管并發(fā)癥的重要機(jī)制。然而，高糖促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明。 晚近有研究發(fā)現(xiàn)，Tribble3通過對(duì)Akt活性的抑制，不僅促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且引起空腹血糖明顯增高，提示TRIB3可能是糖尿病和AS之間聯(lián)系的靶點(diǎn)之一。TRIB基因最早是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，也被稱為神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白激酶，在果蠅發(fā)育早期抑制有絲分裂。人類TRIB家族包括TRIB1、TRIB

3、2、TRIB3，可以在多種細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Hela細(xì)胞中表達(dá)，且其表達(dá)調(diào)節(jié)具有細(xì)胞特異性。果蠅TRIB3是哺乳動(dòng)物的同系物，因此，有關(guān)TRIB基因的研究主要集中在TRIB3。TRIB3可能具有廣泛的生物活性，在空腹?fàn)顟B(tài)下，db—/db—小鼠（一種基因缺陷糖尿病小鼠）肝臟TRIB3的mRNA及蛋白合成顯著增高，繼而導(dǎo)致空腹?fàn)顟B(tài)下肝糖輸出增多，血糖水平升高。TFRIB3可能不僅是糖尿病糖耐量異常的原因，而且可能是高血糖的結(jié)果

4、。但迄今為止，血管內(nèi)皮細(xì)胞上是否存在TRIBs的表達(dá)，高糖是否可促進(jìn)其表達(dá)，以及TRIB3在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用未見報(bào)道。鑒于以上問題，構(gòu)成本研究的設(shè)計(jì)思路和研究目的。 研究目的: 1.采用高糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的模型，用甲基噻唑基四唑（Methylthiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞的存活率； 2.采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time RT

5、—PCR）法探討TRIBs mRNA表達(dá)量與高糖濃度和刺激時(shí)間的關(guān)系； 3.采用免疫熒光法與蛋白免疫印跡（Western—Blot）法檢測(cè)TRIB3，觀察其蛋白表達(dá)量與高糖刺激時(shí)間的關(guān)系； 4.采用siRNA轉(zhuǎn)染抑制TRIB3表達(dá)，Annexin V—FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，探討TRIB3在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。 研究對(duì)象與方法: 本研究以第3～5代HUVECs為研究對(duì)

6、象。采用MTT法、細(xì)胞免疫組織化學(xué)、RT—PCR、Western blotting、Annexin V—FITC/PI雙染法等實(shí)驗(yàn)方法，分別觀察： 1.加入不同濃度葡萄糖（5.5、10、20、30、40mmol/L）分別培養(yǎng)24h、48h、72h，采用MTT法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞存活率： 2.在體外模擬糖尿病狀態(tài)，30mmol/L高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞4h、8h、12h、24h、48h、72h，采用SYRB GreenⅠ染料法

7、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TRIBs mRNA表達(dá)；不同濃度高糖（10、20、30、40mmol/L）及正常條件下刺激內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，檢測(cè)TRIBs mRNA表達(dá)；30mmol/L高糖、25mmol/L甘露醇、正常條件下刺激內(nèi)皮細(xì)胞4h、8h、12h、24h、48h、72h，檢測(cè)TRIB3 mRNA表達(dá)； 3.給予30mmol/L高糖分別刺激HUVECs24h、48h，同時(shí)設(shè)有對(duì)照組，免疫熒光法觀察高糖刺激后TRIB3蛋白的表達(dá)

8、變化； 4.Western—Blot法檢測(cè)30mmol/L高糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞0h、24h、48h、72h后，TRIB3蛋白的表達(dá)； 5.化學(xué)合成TRIB3 siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HUVECs以抑制TRIB3表達(dá)后，Annexin V—FITC/PI雙染流式法檢測(cè)高糖刺激48h后HUVECs的凋亡變化。 結(jié)果: 1.MTT檢測(cè)不同濃度葡萄糖對(duì)HUVECs存活率的影響：與對(duì)照組相比，不同濃度葡萄糖刺激24小

9、時(shí)后，HUVECs的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與對(duì)照組相比，20、30、40 mmol/L葡萄糖處理48h、72h后，HUVECs的存活率顯著降低（P<0.05），并有濃度依賴性，隨著高糖濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。與24h相比，20、30、40 mmol/L葡萄糖處理48h、72h后，細(xì)胞存活率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示細(xì)胞存活率具有時(shí)間依賴性，隨著高糖刺激時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低。

10、 2.30mmol/L高糖刺激HUVECs4h、8h、12h、24h、48h、72h，結(jié)果顯示，TRIB1、TRIB2、TRIB3均能在HUVECs中表達(dá)，高糖可引起TRIB3 mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加。與對(duì)照組相比，高糖刺激12h后，TRIB3 mRNA表達(dá)量增多（P<0.05），24h表達(dá)量最高（P<0.01），48h表達(dá)量其次（P<0.01）。TRIB1、TRIB2mRNA表達(dá)略有增加，與高糖刺激時(shí)間之間無明顯規(guī)律。

11、3.不同濃度葡萄糖處理HUVECs24小時(shí)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，不同濃度（20、30、40mmol/L）的高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞24h后，TRIB3 mRNA表達(dá)量明顯增加（P<0.05），TRIB1、TRIB2 mRNA表達(dá)增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。且高糖刺激HUVECs TRIB3 mRNA表達(dá)增加呈劑量依賴性，30mmol/L高糖刺激作用最強(qiáng)。與對(duì)照組相比，30mmol/L高糖刺激HUVECs24小時(shí)后，TRIB3

12、mRNA增加7.2倍（P<0.01）。 4.不同作用時(shí)間下，以正常濃度、30mmol/L高糖、高滲處理HUVECs，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，30mmol/L葡萄糖組TRIB3 mRNA12h開始升高，24h達(dá)到峰值，其后逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對(duì)照組相比，高滲組TRIB3mRNA僅輕度增多，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示高糖促進(jìn)TRIB3 mRNA的合成與時(shí)間有關(guān)，且這一作用與高糖引起的高滲環(huán)境無關(guān)。 5

13、.以TRIB3 IgG為一抗，免疫熒光染色可見，對(duì)照組、24h高糖組、48h高糖組的細(xì)胞核熒光染色，而細(xì)胞漿未見明顯染色，表明TRIB3在HUVECs的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，胞漿內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)量很少；24h高糖組的細(xì)胞核免疫熒光最強(qiáng)，其次為48h高糖組，對(duì)照組的免疫熒光最弱，表明高糖刺激24小時(shí)時(shí)TRIB3表達(dá)量最高。 6.30mmol/L高糖刺激24h、48h、72h后，Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，72小時(shí)TRI

14、B3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，24小時(shí)及48小時(shí)TRIB3蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05），24小時(shí)蛋白表達(dá)量最高，為正常的5.44倍（P<0.01）。 7.篩選最佳抑制效果TRIB3 siRNA的濃度抑制TRIB3表達(dá)后，30mmol/L高糖刺激HUVECs細(xì)胞48h，Annexin V—FITC/PI雙染流式法結(jié)果顯示，與高糖組相比較，干擾組細(xì)胞凋亡量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論: