1、目的：
　　 肝臟缺血再灌注損傷(Hepatic Isehemic Reperfusion Iniury,HIRI)是肝臟外科疾病中常見的病理過程,在肝臟移植、肝臟良惡性腫瘤、外傷等進(jìn)行的肝部分切除等需要阻斷入肝血流的手術(shù)中,缺血再灌注損傷有著重要作用,可使肝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高,嚴(yán)重者可引起肝功能的損害甚至肝衰竭。近年研究發(fā)現(xiàn)它不僅可以造成肝臟局部的損害,同時(shí)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)釋放大量的細(xì)胞因子、蛋白水解酶、氧自由基和一

2、氧化氮等進(jìn)入體循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)隔器官如肺、腦、腎等,損傷這些臟器,其術(shù)后并發(fā)癥也不斷發(fā)生,甚至導(dǎo)致病人死亡。所以對(duì)肝臟手術(shù)圍術(shù)期的肝及遠(yuǎn)隔器官(如腦和肺)的保護(hù)方面的研究已越來越受到麻醉醫(yī)生和外科醫(yī)生的關(guān)注。因此,對(duì)HIRI的研究,并從麻醉開始采取有效方法進(jìn)行肝臟及其遠(yuǎn)隔器官的保護(hù)具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。我們的前期研究表明,異氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠腦直接的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)異氟烷對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與抑制線

3、粒體內(nèi)Ca2+超載,抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道(MPTP)有關(guān)。但臨床工作中往往存在某一臟器的直接損傷可能會(huì)引起其遠(yuǎn)隔臟器的損傷,異氟烷預(yù)處理除了對(duì)受損器官具有保護(hù)作用是否對(duì)其遠(yuǎn)隔臟器也有保護(hù)作用,其相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道還比較少,本實(shí)驗(yàn)通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷下外周血中S-100β蛋白含量的變化,結(jié)合腦組織線粒體形態(tài)學(xué)的改變,探討異氟烷預(yù)處理對(duì)大鼠肝臟部分缺血再灌注時(shí)對(duì)遠(yuǎn)隔器官是否具有保護(hù)作用。通過腦線粒體游離鈣和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)

4、通道的變化進(jìn)一步探討異氟烷預(yù)處理的作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　 清潔級(jí)健康的SD雄性大鼠60只(由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重250-350g,隨機(jī)分成五組,每組12只,假手術(shù)組(S組);入腹后只分離肝十二指腸韌帶,但不阻斷肝門血供:缺血再灌注組(IR組):肝臟缺血60min,再灌注120min;異氟烷預(yù)處理組(ISO組):肝臟I/R前60min ISO預(yù)處理30

5、min,后在空氣中洗脫30min;CsA+ISO組:CsA(MPTP特異性阻滯藥)50mg kg-1腹腔內(nèi)注射,30min后同ISO組。CsA組:I/R前30minCsA50mg kg-1腹腔內(nèi)注射。
　　 二、動(dòng)物模型的制作
　　 參照在體大鼠全肝缺血-再灌注損傷模型的制作方法加以改進(jìn),10％水合氯醛(0.35g·kg-1)腹腔內(nèi)注射麻醉,采用腹部弧形切口,入腹后分離肝十二指腸韌帶,應(yīng)用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷肝左葉及中葉血流6

6、0min后松開動(dòng)脈夾,再灌注120min,Iso組于缺血前60min置于實(shí)驗(yàn)艙內(nèi),持續(xù)吹入異氟烷和空氣30min,維持艙內(nèi)濃度在1.2-1.5％左右(Datex-Ohmeda氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)),再放入空氣中洗脫30min,各組分別于缺血前及再灌注120min后抽取靜脈血,取血清-80℃冰箱保存,備用,各組均在再灌注120min后迅速斷頭取腦,在-4℃的冰水中取腦組織,取部分腦組織2.5％戊二醛固定,制作電鏡標(biāo)本。另一部份置于-80℃液氮保

7、存,用以制備線粒體懸液。
　　 三、觀察指標(biāo)和測(cè)定方法
　　 (一)血清S-1OOβ蛋白含量的測(cè)定
　　 各組靜脈血離心后所得血清置于-80℃的冰箱保存,應(yīng)用Elisa試劑盒(購自大連生物科技有限公司)按試劑盒所述方法進(jìn)行測(cè)定。
　　 (二)腦組織線粒體形態(tài)學(xué)改變
　　 取部分腦組織,2.5％戊二醛緩沖液中固定制成電鏡切片,觀察線粒體的變化。
　　 (三)腦線粒體懸液的制備
　　

8、低溫差異法分離線粒體,用分離介質(zhì)制成懸浮液。取該懸浮液少許用中性紅-詹納斯綠B染色后,在高倍顯微鏡下觀察,被染成亮綠色顆粒即線粒體。整個(gè)過程均在0～4℃中進(jìn)行。
　　 四、統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,組內(nèi)和組間比較均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和配對(duì)t檢驗(yàn)(paired-sampie T test),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

9、P＜0.01為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 一、外周血中S-1OOβ蛋白含量的變化
　　 再灌注后,IR組S-100β蛋白含量顯著高于S組(p＜0.01);Iso組與IR組相比S-100β含量明顯下降(p＜0.05),CsA+Iso組和CsA組與S組比較顯著升高(p＜0.01),與Iso組比較也升高顯著(p＜0.05),IR組,CsA+Iso組和CsA組三組之間無顯著差異;IR組,CsA+Iso組和CsA組

10、與缺血前比較明顯升高(p＜0.01),缺血前S-100β蛋白含量的變化,五組無顯著性差異。
　　 二、腦線粒體超微結(jié)構(gòu)變化
　　 ISO組線粒體結(jié)構(gòu)較完整,嵴及內(nèi)膜間隙仍清晰可見,與S組比較未見明顯損傷,IR、CsA+ISO和CsA組線粒體渾濁腫脹,嵴斷裂、溶解,內(nèi)呈空泡狀。
　　 三、腦線粒體Ca2+濃度的變化
　　 IR組Ca2+濃度明顯高于S組和ISO組(P＜0.01),而CsA+ISO組Ca2+濃

11、度明顯高于ISO組(P＜0.01);說明ISO預(yù)處理抑制了IR后Ca2+濃度升高,而這種作用在事先用mitoKATP特異性阻滯藥CsA后被取消。
　　 四、MPTP開放程度(AS)的變化
　　 IR組有較低的△S值,即較大MPTP開放,與S組和ISO組比較有顯著差異(P＜0.01),而CsA+ISO組的△S值明顯低于ISO組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 肝臟部分缺血再灌注對(duì)腦有損傷作用,而異氟烷