1、人感染乙型肝炎病毒(hepatitis b vius,HBV)后可導致急性自限性肝炎,或者轉為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)。盡管只有3～10％個體感染HBV后成為CHB患者,但據世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全世界超過20億人感染過HBV,CHB人口仍巨大。我國多年來一直是HBV感染的高流行區(qū),全國約有1.2億CHB患者。乙型肝炎慢性化的機制比較復雜,仍然有待進一步闡述。
　　 HBV感染人體后,特異性T、B

2、淋巴細胞可清除病毒。然而CHB患者在感染急性期HBV DNA水平較高,進入慢性期后HBV DNA水平維持在較低水平,免疫系統(tǒng)未能成功清除病毒,導致了HBV持續(xù)存在。目前較多的研究認為HBV結構基因選擇性突變逃避宿主免疫監(jiān)測,但HBV調控序列中增強子的變異對HBV基因組的轉錄與復制水平的下調作用導致感染慢性化的機制卻較少報道。HBV基因組上有二個增強子序列。研究表明HBV增強子Ⅰ(enhancerⅠ,EnhⅠ)對HBV基因組的轉錄與復制起

3、重要調控作用,其序列上的突變與HBV感染慢性化的相關性未見報道。
　　 本研究擬選取CHB患者,采用PCR技術對HBV EnhⅠ區(qū)域DNA進行擴增并直接測序,采用Genotyping軟件分析序列并鑒定其基因型(genotype),利用DNAMAN軟件將獲得的HBV序列與genebank上相應基因型HBV參考株序列比對以分析變異,同時檢測血清中HBV DNA水平、免疫學指標HBsAg、HBeAg滴度,分析EnhⅠ基因變異與HBV

4、DNA水平、HBsAg和HBeAg滴度的關聯(lián)性,以分析EnhⅠ基因變異對乙肝慢性化的影響。
　　 目的(1)比較Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix擴增HBV靶DNA保真度影響。(2)研究江西地區(qū)CHB患者體內HBV EnhⅠ區(qū)域基因變異。(3)研究CHB患者HBV EnhⅠ基因變異對血清HBV DNA水平及HBsAg、HBeAg滴度影響。
　　 方法：(1)取CHB患者血清與

5、陰性對照血清標本各一份,抽提血清中DNA,采用Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix分別擴增HBV DNAnt835-nt1396片段,PCR產物測序并DNAMAN軟件進行比對。(2)收集來我院就診的CHB患者70名,其中“大三陽”35例,“小三陽”35例,健康體檢者2名血清,PCR擴增HBV EnhⅠ基因,產物測序后利用Genbank中Genotyping對HBV進行分型,利用DNAMAN軟件

6、與標準株比對分析DNA序列中的變異位點。熒光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)法定量檢測血清HBV DNA拷貝數,倍比稀釋血清后用ELISA法檢測HBsAg、HBeAg滴度。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,HBV DNA拷貝數以其對數值計算(x)±S,滴度均值采用幾何均數表示。陽性率比較采用x2檢驗,組間比較HBV DNA拷貝數陽性對數均值差異采用多應變量方差分析,兩兩比較均采用不假

7、定方差相等Dunnett’s T3檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：(1)二種PCR試劑均能特異地擴增出HBV靶基因片段,PCR產物測序比對結果顯示,Taq PCR MasterMix擴增產物與Taq Plus PCR MasterMix擴增產物相比,產生了nt1390缺失和nt1389T→C及nt1392G→T二個突變位點。(2)70例乙肝患者HBV DNA測序后經Genotyping比對,均屬于B型,與參考

8、序列AF100309同源性最高,CHB患者HBV ErdaⅠ主要變異位點為:nt1010A→T,nt1013G→A,nt1031T→C,nt1034A→G,nt1053C→T,nt1082A→T,nt1133G→A,nt1167C→T,nt1223C→A,nt1227G→C,nt1230A→C,nt1241T→A,nt1244G→A,nt1246C→A,m1251C→G,m1289A→C,nt1349A→C。(4)CHB患者HBV En

9、hⅠ區(qū)域nt1133G→A變異對應的HBV DNA拷貝數與HBsAg、HBeAg滴度明顯降低。
　　 結論：(1)兩種不同PCR試劑中Taq和Pfu混合DNA聚合酶的Taq Plus PCRMasterMix試劑催化PCR反應中HBV靶DNA片段擴增的保真度高于Taq DNA聚合酶。(2)江西地區(qū)乙肝患者感染HBV基因型主要為B型,HBV EnhⅠ區(qū)域nt1133G→A可降低EnhⅠ功能,下調HBV基因表達,ErdaⅠ區(qū)域基因變