1、背景和目的:肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤，在我國僅次于肺癌位列第二，其死亡率位于惡性腫瘤病死率的第三位，主要原因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者伴隨基礎(chǔ)的肝臟疾病，如肝硬化、肝功能代償失調(diào)，手術(shù)切除效率低，放療和化療的效果差等，所以尋求新的有效的肝癌治療藥物或方法顯得尤為重要。利用抑癌基因、腫瘤抑制基因或免疫調(diào)節(jié)基因等進(jìn)行的腫瘤靶向治療是生物基因治療的重要研究內(nèi)容，與傳統(tǒng)的治療方法相比，它具有腫瘤特異性，殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)基本不損傷正常組織，被認(rèn)為是腫瘤

2、治療中最具前景的治療方法。但目前的難題在于:病毒基因載體的靶向性較差，尤其是對于較隱蔽的腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶或術(shù)后復(fù)發(fā)病灶，載體很難被準(zhǔn)確運(yùn)送到這些部位?；谶@些問題，探索安全有效靶向性更好的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)成為基因治療研究的重要課題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類存在于多種組織，具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs具有向炎癥、腫瘤部位定向趨化，低免疫原性，易于進(jìn)行基因改造等優(yōu)點(diǎn)，已成為基因治療的理

3、想載體。本研究基于上述理論，探索出一套有效的靶向治療系統(tǒng)，即利用E1A基因修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)復(fù)制包裝出攜帶由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子(human telomerase reverse transcriptase promoter, hTERTp)驅(qū)動的特異抑瘤基因IL24的腺病毒，通過HUMSCs向腫瘤部位歸巢的能力，在腫瘤部位釋放出攜帶此治療基因的腺病毒顆粒發(fā)揮抗腫瘤作用，本課題重點(diǎn)研究這套靶向治療體系單獨(dú)或聯(lián)合5-

4、FU在體內(nèi)外對HepG2肝癌移植瘤模型的治療作用。
　　方法:利用組織塊貼壁法從臍帶華通氏膠組織(Wharton's Jerry，WJ)中分離培養(yǎng)HUMSCs;流式細(xì)胞術(shù)分析HUMSCs陽性及陰性的表面標(biāo)志;利用成骨、成脂誘導(dǎo)體系鑒定HUMSCs的分化潛能。利用PCR、重疊PCR(overlap PCR)、酶切、連接等分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建pGL3-hTERTp報(bào)告基因載體及pLentiR.E1A、pAd-hTERTp-IL24、pA

5、d-CMV-Luc慢病毒及腺病毒表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證其基因序列的正確性。利用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，利用293A細(xì)胞包裝腺病毒顆粒，并感染HUMSCs確定各自合適的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）。將pGL3-hTERTp、pGL3-Basic及pGL3-Control三種報(bào)告基因載體分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)染hTERT陽性的腫瘤細(xì)胞及其陰性的MRC-5和HUMSC，利用雙熒光素酶的方法鑒定hT

6、ERT啟動子的轉(zhuǎn)錄特異性。利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測MSC.LentiR+Ad-Track和MSC.LentiR.E1A+Ad-Track中不同時(shí)間點(diǎn)的病毒相對拷貝數(shù)。體外利用Transwell的方法研究雙病毒感染對HUMSCs向HepG2細(xì)胞趨化的影響;采用皮下接種的方法建立HepG2肝癌移植瘤模型，尾靜脈注射MSC.LentiR+Ad-CMV-Luc或MSC.LentiR.E1A+Ad-CMV-Luc至荷瘤小鼠體內(nèi)，IVIS成

7、像系統(tǒng)觀察其向腫瘤部位的歸巢情況。體外采用CCK8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測Ad-hTERTp-IL24與低劑量5-FU聯(lián)用對HepG2肝癌細(xì)胞系生長的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡的能力。體內(nèi)，對HepG2肝癌移植瘤模型聯(lián)合應(yīng)用MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24和低劑量5-FU進(jìn)行治療，每3天測量腫瘤直徑，根據(jù)腫瘤體積計(jì)算抑瘤率，評價(jià)療效;治療結(jié)束后取出腫瘤組織，固定后制作石蠟切片，利用免

8、疫組化的方法觀察腫瘤組織中MSC的分布及IL24的表達(dá)情況;TUNEL的方法檢測腫瘤組織中細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:成功從臍帶WJ組織中分離培養(yǎng)HUMSCs，鑒定其表面MSCs陽性標(biāo)志CD73、CD90、CD105均為強(qiáng)陽性，MSCs陰性標(biāo)志如CD34、CD19、CD45均為陰性，并且可以在體外被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞。成功構(gòu)建載體pGL3-hTERTp、pLentiR.E1A、pAd-CMV-Luc及pAd-hTERTp-I

9、L24，經(jīng)測序證明其基因序列正確。雙熒光素酶的方法驗(yàn)證hTERT啟動子在不同的腫瘤細(xì)胞中具有較高的轉(zhuǎn)錄活性，而在正常細(xì)胞如MRC-5及HUMSCs細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性極低，說明克隆的hTERT啟動子片段具有特異的轉(zhuǎn)錄活性。腺病毒Ad-Track及慢病毒LentiR.E1A共同感染HUMSCs后，隨著腺病毒早期復(fù)制基因E1A逐漸被表達(dá)，Ad-Track利用E1A在HUMSCs中啟動復(fù)制程序，產(chǎn)生更多的腺病毒顆粒，最終將MSC裂解并釋放具有感染能

10、力的病毒顆粒。體外，荷載病毒的HUMSCs在LentiR.E1A感染32h之內(nèi)可以穿過transwell小室向培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的下室遷移。體內(nèi)建立BALB/C裸鼠HepG2肝癌移植瘤模型，尾靜脈注射MSC.LentiR.E1A+ Ad-CMV-Luc后，第1天遷移并聚集于腫瘤部位;第2天生物發(fā)光信號開始減弱直至第4天消失;而在第7天時(shí)又在腫瘤部位檢測到生物發(fā)光信號，為釋放的腺病毒顆粒感染腫瘤細(xì)胞所致。Ad-hTERTp-IL24具有特

11、異的抑瘤作用，與5-FU聯(lián)用不僅增強(qiáng)IL24的抗腫瘤作用，還可以通過增加腫瘤細(xì)胞攝取腺病毒的方式，達(dá)到協(xié)同的抗腫瘤作用。體內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射MSC.LentiR.E1A+Ad-hTERTp-IL24并聯(lián)合低劑量5-FU對HepG2移植瘤的生長具有明顯抑制作用，療效優(yōu)于單獨(dú)治療。
　　結(jié)論:本課題首次建立由MSC.LentiR.E1A運(yùn)載攜帶腫瘤治療基因的復(fù)制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-IL24的雙重靶向治療系統(tǒng)，與5-FU聯(lián)用可