1、目的:本研究運用Real time PCR(實時定量PCR)技術,觀察IGF-1(胰島素生長因子-1)mRNA在糖尿病大鼠膀胱的表達變化。進一步說明IGF-1的表達變化在糖尿病性膀胱病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 糖尿病性膀胱病(diabetic cystopathy,DCP)是一種糖尿病泌尿系統(tǒng)的并發(fā)癥,主要是由糖尿病周圍神經(jīng)病變引起的膀胱功能障礙,其發(fā)病與年齡、性別無關。并且其起病隱匿,早期無明顯癥狀,出現(xiàn)癥狀時已經(jīng)是晚期,早期

2、診斷比較困難。其臨床特點是排尿量和排尿次數(shù)的改變、排尿困難、尿失禁、膀胱容量增大、出現(xiàn)殘余尿以及泌尿系的感染。對于糖尿病性膀胱病目前尚無特效地治療方法,治療仍然是以治療糖尿病為主,并輔以其他治療措施。這種治療方法對于早期糖尿病性膀胱病可以延緩病程的進展,但是對于晚期患者這種方法無法有效地逆轉膀胱癥狀。導致晚期患者的生活質量較差。因此,糖尿病性膀胱病的早期診斷、治療和病因的研究已成為相關學科研究人員關注的重點。近年來,隨著分子生物學、細胞

3、生物學、細胞生理學和神經(jīng)生物、生理學的發(fā)展進步,特別是在神經(jīng)創(chuàng)傷修復與神經(jīng)退行性疾病預防和治療方面的深入研究,對一些與神經(jīng)分化發(fā)育及再生修復密切相關的生物活性物質,如胰島素生長因子(IGF)、神經(jīng)生長因子(NGF),進行了廣泛而深入的研究,在理論以及應用方面都取得了長足的進展。目前研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長-I(insulin-like growthfactor I,IGF-1)是一種具有多種生物學功能的細胞因子,可促進細胞分化,增殖,抑制凋

4、亡。尤其IGF-1對神經(jīng)細胞、成骨細胞等的增殖分化起關鍵調(diào)節(jié)作用,有助于神經(jīng)細胞受損后的功能恢復,現(xiàn)在已被證實對神經(jīng)系統(tǒng)起重要的營養(yǎng)保護作用。在糖尿病性膀胱病方面,目前國內(nèi)外都將焦點放在了NGF和糖尿病性膀胱病的關系上,目前關于IGF-1與糖尿病性膀胱病的關系的研究較少,尚處于起步階段。而Real time PCR(實時定量PCR)技術在檢測IGF-1因子上有先天的優(yōu)勢。和其他實驗方法相比,不僅操作簡單,而且更加客觀、準確。這種方法對R

5、NA的質量要求還很低,可以檢測到極低濃度的mRNA。
　　 本研究可為今后糖尿病性膀胱病的研究與治療提供實驗依據(jù),為糖尿病性膀胱病的研究與治療提供新的、有效的途徑。
　　 方法:
　　 1：實驗動物及分組:所用動物為30只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供,體重200～250g。隨機分成3組,正常對照組10只,糖尿病組10只,治療組10只。SD大鼠禁食12h以上,糖尿病組

6、、治療組大鼠按60mg/kg腹腔注射STZ。對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。注射STZ72小時后測空腹尾靜脈血葡萄糖濃度(bloodglucose,BG)。BG＞16.7mmol/L為造模成功。將造模成功的大鼠按血糖高低隨機分為糖尿病組、治療組。治療組SD大鼠在造模成功后第二天,給予皮下注射精蛋白鋅胰島素,使BG維持在3.9～10mmol/L。正常對照組、糖尿病組大鼠同時給予皮下注射相同容積的生理鹽水。三組均于造模成功后8周后進行實

7、驗。
　　 2：實時定量PCR:RNA提取采用的是天根生化科技北京有限公司的TRNzol Reagent,按說明書操作。cDNA第一鏈的合成采用的是天根生化科技北京有限公司的Quant cDNA第一鏈合成試劑盒,按說明書操作。內(nèi)參基因采用的是β-actin,引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。熒光定量PCR采用的是20ul反應體系,包括:2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution9ul,cDNA2

8、ul,10umol/ul的引物各0.5ul,超純水8ul。反應在AB17500熒光定量PCR儀中進行。反應條件為:95℃起始模板變性2分鐘,1個循環(huán),95℃PCR循環(huán)中模板變性20秒,60℃退火30秒,68℃延伸50秒,40個循環(huán),68℃時檢測熒光。分析軟件通過樣本中的熒光強度得到IGF-1、β-actin的Ct值。
　　 3：統(tǒng)計學分析:根據(jù)IGF-1、β-actin的Ct值,運用2-△△Ct方法計算,以△Ct=Ct IGF-

9、1(目的基因)-Ctβ-actin(內(nèi)參照基因)表示基因的相對拷貝數(shù),△Ct值越低,實際拷貝數(shù)越高,基因表達量越高。
　　 IGF-1、β-actin的基因表達量以均數(shù)±標準差方法表示((x)±s)單因素方差分析進行統(tǒng)計,以P＜0.05具有統(tǒng)計學意,用SPSS18.0件包完成。
　　 結果:
　　 大鼠膀胱組織IGF-1 mRNA表達變化:正常對照組、糖尿病組、治療組大鼠膀胱組織總RNA經(jīng)Real time PC

10、R(實時定量PCR)后,△Ct值見圖表(Table.1)。IGF-1 mRNA在糖尿病組的表達量為6.141±0.916,在正常對照組的表達量為4.018±0.491,在治療組的表達量為4.922±788。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析(Table.2),可見IGF-1 mRNA在糖尿病組表達量明顯下調(diào)(p＜0.05)。經(jīng)胰島素治療后可上調(diào)IGF-1 mRNA的表達量(p＜0.05,Fig.1)。
　　 結論:
　　 本實驗通過運