1、近年來(lái)，新型隱球菌感染不斷增多，由其引起的隱球菌性腦膜炎也成為臨床腦膜炎的重要病原。新型隱球菌致病力主要由其細(xì)胞壁的多糖莢膜所介導(dǎo)，其中莢膜相關(guān)蛋白是莢膜形成的必須組分，在新型隱球菌感染的診斷和治療中具有重要作用，但目前對(duì)新型隱球菌致病機(jī)制及感染診斷仍然缺乏系統(tǒng)深入的研究。目前報(bào)道有四種與新型隱球菌致病相關(guān)的莢膜相關(guān)蛋白，其中的CAP10蛋白，是繼CAP59、CAP60、CAP64后于近年研究報(bào)道，目前未見(jiàn)針對(duì)該蛋白的免疫診斷和感染檢測(cè)

2、的研究報(bào)道。本研究針對(duì)新型隱球菌莢膜相關(guān)蛋白CAP10制備了特異性抗-CAP10的單克隆抗體，為臨床新型隱球菌的檢測(cè)和血清型分析奠定了基礎(chǔ)：同時(shí)對(duì)檢測(cè)新型隱球菌感染的兩種免疫學(xué)檢測(cè)方法在臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)行了比較分析，為臨床新型隱球菌感染的免疫學(xué)檢測(cè)提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　 1.新型隱球菌CAP10蛋白的重組表達(dá)及單克隆抗體制備：
　　 ①新型隱球菌CAP10蛋白的重組表達(dá)：采用生物信息技術(shù)對(duì)莢膜相關(guān)蛋白CAP10進(jìn)行

3、抗原表位預(yù)測(cè)分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白S1區(qū)段(70-215aa片段)在隱球菌病主要致病菌(血清型A、D、AD)中保守性最高，S2區(qū)段(350-510aa片段)只識(shí)別格特隱球菌和部分新生隱球菌。為了在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行有效表達(dá)，采用密碼子優(yōu)化技術(shù)優(yōu)化并合成了上述2個(gè)區(qū)段基因，克隆至原核表達(dá)載體pQE30中。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌后經(jīng)誘導(dǎo)，成功表達(dá)出莢膜相關(guān)蛋白CAP10-1(70-215aa)重組蛋白。該重組蛋白分子量約為25kD，重組蛋白以包

4、涵體形式表達(dá)，經(jīng)純化后獲得目的重組蛋白。
　　 ②抗-CAP10蛋白的單克隆抗體制備及鑒定：用純化的重組蛋白CAP10免疫Balb/c小鼠，經(jīng)過(guò)2次免疫，血清抗體效價(jià)達(dá)到適當(dāng)水平時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合；經(jīng)有限稀釋進(jìn)行亞克隆和篩選后，得到11株分泌抗-CAP10的單克隆抗體細(xì)胞株。腹水中11株單抗效價(jià)大于1:50萬(wàn)。對(duì)11株獲得的單克隆抗體通過(guò)ELISA檢測(cè)其特異性。將重組表達(dá)的CAP10-2(350-510aa)重組蛋白用作對(duì)照蛋白，同

5、時(shí)再分別以大腸桿菌裂解蛋白和購(gòu)買(mǎi)的莢膜相關(guān)蛋白CAP59蛋白為對(duì)照抗原進(jìn)行包被，采用間接ELISA法檢測(cè)制備的單克隆抗體。上述抗體只與CAP10-1重組蛋白反應(yīng)；與莢膜相關(guān)蛋白CAP10的另一區(qū)段表達(dá)的重組蛋白CAP10-2不反應(yīng)，與其它蛋白也無(wú)交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，制備的上述單克隆抗體是針對(duì)莢膜相關(guān)蛋白CAP10的特異性單抗。抗-CAP10單抗的成功制備為臨床新型隱球菌的檢測(cè)和血清型的分析奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.新型隱球菌檢測(cè)方

6、法的比較及在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用：經(jīng)病原分離培養(yǎng)后，以墨汁染色方法檢測(cè)陽(yáng)性的病例作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用膠體金和乳膠凝集方法對(duì)40例腦膜炎腦脊液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分別比較兩血清學(xué)方法檢測(cè)新型隱球菌的敏感度和特異性。與墨汁染色方法比較，膠體金和乳膠凝集方法檢測(cè)腦膜炎腦脊液標(biāo)本原液時(shí)，其特異性分別為58.3％(14/24)和66.7%(16/24)。都存在一定假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率分別為41.7%(10/24)和33.3%(8/24)。將臨床標(biāo)本進(jìn)行20倍稀釋

7、后進(jìn)行檢測(cè)以降低假陽(yáng)性率。檢測(cè)結(jié)果表明，與墨汁染色方法比較，膠體金方法和乳膠凝集方法敏感性達(dá)到87.5%(14/16)，特異性為95.8%(23/24)，兩種方法的特異性顯著提高。在經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)診斷確診的14例結(jié)核性腦膜炎標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本為原液時(shí)，用膠體金試劑檢測(cè)呈現(xiàn)出6例陽(yáng)性，其中4例乳膠凝集方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，假陽(yáng)性率高。采用標(biāo)本稀釋后進(jìn)行檢測(cè)則消除了假陽(yáng)性。結(jié)果表明，乳膠凝集和膠體金檢測(cè)方法可有效應(yīng)用于臨床結(jié)核性腦膜炎的鑒別