1、目的： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種發(fā)生于中老年的以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力下降為主的退行性神經(jīng)病變。其典型的病理改變是神經(jīng)細(xì)胞間出現(xiàn)大量以β—淀粉樣肽(β—Amyloid，Aβ)為核心的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)元的胞體中出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)等。AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，但自由基損傷學(xué)說和細(xì)胞凋亡學(xué)說備受

2、人們的關(guān)注。自由基形成和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，進(jìn)一步引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致AD的功能退化和神經(jīng)變性的基礎(chǔ)。p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(P75 neurotrophin receptor，P75NTR)是神經(jīng)營養(yǎng)素的低親和力受體，與AD神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。p75NTR誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)通路目前仍不十分清楚，但已廣泛公認(rèn)的是其對(duì)c—jun氨基末端激酶(c—jun N-Terminal kinase，JNK)的激活是介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，并進(jìn)一步通

3、過激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表達(dá)，促進(jìn)或引起細(xì)胞凋亡。此外，JNK還能通過誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放進(jìn)一步活化Caspase—3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 研究并建立可靠的AD動(dòng)物模型對(duì)于探明AD的病因、發(fā)病機(jī)制及防治藥物的研發(fā)均有重要的意義。到目前為止用于AD研究的動(dòng)物模型很多，其中給小鼠慢性注射D—半乳糖(D—galactose，D—gal)已成為一種常見的制備方法，廣泛用于AD等神經(jīng)退行性疾病的藥理學(xué)研究。此外，轉(zhuǎn)基因模型是一種病因

4、模型，過量表達(dá)人源性突變AD相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因鼠，因其具有明確的病因，并能反映AD的部分病理與功能變化，有助于我們了解AD的發(fā)病機(jī)制，也逐漸成為研究AD的整體模型。 防治AD的抗氧化劑及抗凋亡藥物的研究與開發(fā)成為當(dāng)今藥理學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題之一。(一)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin—3—gallate，EGCG)是綠茶的一種主要多酚成分，研究證實(shí)綠茶有效的鐵螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神經(jīng)保護(hù)等作用的發(fā)揮

5、主要依賴于EGCG。Levites等通過研究人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞和大鼠成纖維細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)EGCG能夠減少具有神經(jīng)毒性作用的Ap的產(chǎn)生。因此，本研究擬通過D—半乳糖皮下注射建立的AD小鼠模型及遺傳性的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，采用Nissl、TUNEL染色、免疫組化、Western blot等方法研究D—半乳糖對(duì)小鼠認(rèn)知行為、病理改變、抗氧化能力、細(xì)胞凋亡、Aβ(1—40)、淀粉樣前體蛋白(Amyloid prec

6、ursor Protein，APP)、促凋亡蛋白caspase—3及P75—JNK-P53凋亡相關(guān)通路的影響，以及9月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠上述指標(biāo)的改變，同時(shí)進(jìn)一步探討EGCG對(duì)兩種AD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 材料與方法： D—半乳糖誘導(dǎo)的AD模型鼠實(shí)驗(yàn)：取昆明系小鼠96只，隨機(jī)分成6組，每組16只，即空白對(duì)照組(Control)、模型組1(D—gal+ddH2O)、模型組2(D—gal+oil)

7、、VE陽性對(duì)照組(D—gal+280IU/kg VE)、EGCG低劑量處理組(D—gal+2 mg/kg EGCG)、EGCG高劑量處理組(D—gal+6 mg/kg EGCG)。每日給兩模型組及VE陽性對(duì)照組、EGCG低劑量及高劑量處理組小鼠按150 mg/kg皮下注射3％的D—半乳糖一次，空白對(duì)照組小鼠每天皮下注射等體積的生理鹽水一次，連續(xù)注射6周。第三周開始給VE陽性對(duì)照組、EGCG低劑量及高劑量處理組小鼠每日分別按280IU/k

8、g灌胃5.6％VE、按2 mg/kg灌胃0.04％的EGCG、按6 mg/kg灌胃0.12％的EGCG一次，空白對(duì)照組及模型組1小鼠灌胃等量的雙蒸水一次，模型組2灌胃等量的大豆油一次，連續(xù)給藥4周。最后一周對(duì)小鼠進(jìn)行水迷宮、避暗及自主活動(dòng)等行為學(xué)檢測，其間繼續(xù)給藥。行為學(xué)結(jié)束后，快速取一部分小鼠海馬入—80℃中凍存，分別進(jìn)行SOD、GSH-Px酶活性、MDA含量的測定及Western blot印跡分析APP、caspase—3、P75、

9、JNK2及P53等蛋白表達(dá)水平。另一部分小鼠進(jìn)行腦灌流固定，分別進(jìn)行HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及Aβ(1—40)、caspase—3、APP等免疫組化的檢測。 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)取C57小鼠10只及APP/PS1小鼠20只，隨機(jī)分成3組：C57對(duì)照組(Control)、模型組(APP/PS1)、實(shí)驗(yàn)組(APP/PS1+2 mg/kg EGCG)。每日給實(shí)驗(yàn)組APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠按2 mg/kg灌胃0

10、.04％的EGCG一次，給對(duì)照組及模型組小鼠灌胃等量的雙蒸水一次，連續(xù)灌胃4周。最后兩日對(duì)小鼠進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)檢測，其間繼續(xù)給藥。行為學(xué)結(jié)束后，快速取一部分鼠海馬入—80℃中凍存，進(jìn)行Western blot印跡分析P75、JNK2及P53等蛋白表達(dá)水平。另一部分小鼠進(jìn)行腦灌流固定，進(jìn)行HE染色及Aβ(1—40)免疫組化的檢測。 結(jié)論： 1、EGCG能夠改善D—半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)

11、記憶障礙。 2、EGCG能夠提高D—半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠海馬內(nèi)的抗氧化酶活性，發(fā)揮有效的抗氧化作用。 3、EGCG通過抑制D—半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠大腦皮層及海馬內(nèi)的APP及Aβ(1—40)蛋白水平，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。 4、EGCG通過抑制D—半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)p751CD、JNK2及P53凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步抑制caspase—3蛋白活性，對(duì)神