1、目的:
　　眾所周知，胰腺癌是一種消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，5年生存率小于5％。盡管外科手術和化療有了很大的改進，但近20年來胰腺癌患者的預后并未有明顯的改善，手術切除的患者生存率僅為17％。因此，更加全面深入地了解胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機制及其內在的分子生物學特性，尋找積極的診治手段，探索有效的治療靶點成為多年來胰腺癌研究的焦點問題。很多資料顯示胰腺癌組織中缺氧誘導因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1

2、α)的表達與預后密切相關，其蛋白表達強弱與淋巴結轉移及臨床分期等正相關，因此HIF-1α可能做為新的胰腺癌治療靶點。
　　ROS(ReactiveOxygenSpecies)包括超氧陰離子自由基、H2O2、次氯酸鹽、羥自由基等，是線粒體氧化磷酸化過程中電子呼吸傳導鏈有氧代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。適量的ROS可通過激活促增長轉錄因子(c-fos和c-jun)、促進腫瘤細胞的存活；但如果ROS過度累積，可以引起腫瘤細胞的氧化應激，導致細

3、胞損傷直至死亡的重要因素。
　　本研究擬明確腫瘤細胞中缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)對線粒體氧化呼吸和活性氧生成的作用，并首次深入揭示HIF-1α對FOXO(forkheadtranscriptionFactor)轉錄因子的調控機制和其他ROS還原劑的作用。通過對上述機制的研究，評估HIF-1α抑制劑和ROS誘導劑聯(lián)合治療胰腺癌的效果。
　　方法：
　　一、HIF-1α對ROS的清除作用：利用Rotenone阻斷線

4、粒體呼吸，終止ROS的產(chǎn)生，利用流式細胞術檢測過表達及干擾HIF-1α前后，細胞內ROS的含量情況。細胞采用人胰腺癌細胞MIAPACA-2為研究對象。
　　二、HIF-1α對FOXO1的轉錄調節(jié)研究和ROS還原系統(tǒng)的作用：
　　1.細胞培養(yǎng)和處理：細胞同上。細胞經(jīng)DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期時，將細胞收集至六孔板中做不同的處理；
　　2.Westernblot法檢測蛋白變化及實時定量PCR法檢測m

5、RNA變化：比較干擾和過表達HIF-1α前后FOXO1及下游ROS還原劑蛋白水平和mRNA的變化；
　　3.染色體免疫共沉淀(Chip)檢測HIF-1α與FOXO1啟動子的HRE直接結合。
　　4.雙熒光素酶實驗：構建FOXO1基因啟動子熒光素酶表達載體，與HIF-1α過表達載體共轉染細胞，觀察HIF-1α對FOXO1基因的轉錄調節(jié)效應。
　　三、HIF-1α抑制劑和ROS誘導劑對胰腺癌細胞的體外藥敏作用：
　　

6、1.MTT法檢測藥物的IC50及協(xié)同效應：檢測HIF-1α抑制劑2ME和ROS誘導劑As203的IC50以及兩個藥物聯(lián)合應用時的協(xié)同效應最大比例。
　　2.細胞凋亡檢測：最大協(xié)同比例的兩種藥物處理胰腺癌細胞時的凋亡檢測，利用PI及AnnexinV-FITC染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　3.細胞周期檢測：單藥及聯(lián)合用藥后細胞周期的變化，75％酒精固定處理的細胞24h，經(jīng)PI染色，采用流式細胞儀檢測細胞周期。
　

7、　四、裸鼠體內試驗：取四周齡體重相近的雌性裸鼠32只，左下腹部皮下成瘤后隨機分成四組，分別為對照組、2ME組、As2O3組、2ME和As2O3合用組，治療一個周期，監(jiān)測老鼠體重、飲食、腫瘤大小變化情況。
　　結果：在胰腺癌細胞系MIAPACA-2中干擾HIF-1α僅的表達后細胞內ROS累積增多。并且我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達與FOXO1及其下游相關基因的表達正相關。我們還發(fā)現(xiàn)在HIF-1α過表達的細胞中干擾了FOXO1的表達后，細

8、胞內仍舊出現(xiàn)了ROS的累積，說明HIF-1α清除ROS確實通過FOXO1及其下游基因來實現(xiàn)。進一步我們通過CHIP實驗證實HIF-1α可與FOXO1啟動子區(qū)的HRE直接結合，雙熒光素酶報告基因也同時驗證了FOXO1啟動子區(qū)HRE的功能。在體外藥物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)2ME和As2O3單獨應用均能促進胰腺癌細胞凋亡，且聯(lián)合用藥時二者具有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用的機制有周期阻滯，細胞內ROS累積，微管解聚等。在體內藥敏實驗中，HIF-1α抑制劑和