1、由于環(huán)境鉛污染的普遍性和腎臟對鉛毒作用的敏感性，目前鉛性腎病的危害在國際、國內(nèi)都是較普遍的。鉛對腎臟的毒性作用是一個隱匿而漸進的過程，早期是亞臨床型的，可逆的，發(fā)展到一定階段即不可逆轉(zhuǎn)。研究資料顯示鉛對腎臟的毒作用部位主要在腎近曲小管。鉛性腎病病理學改變早期主要在腎小管上皮細胞內(nèi)形成包涵體、損傷腎小管上皮細胞，繼而逐步出現(xiàn)腎小管萎縮、腎單位丟失、腎間質(zhì)纖維化導致腎功能低下。但目前對鉛的腎臟主要靶細胞-腎小管上皮細胞損傷的細胞機制、分子機

2、制知之甚少。本課題首先以正常人腎小管上皮細胞系(HK-2)為研究對象，觀察醋酸鉛致HK-2細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化作用，其劑量反應關(guān)系，以及對細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化信號通路相關(guān)分子的影響和碘化鉀的干預作用。 在此基礎(chǔ)上，本課題運用功能蛋白質(zhì)組學方法，分離鑒定與鉛有高親和性的結(jié)合蛋白，探討鉛致HK-2細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化的內(nèi)在原因。以往的研究顯示，鉛可在細胞內(nèi)與蛋白質(zhì)形成高親和性的鉛結(jié)合蛋白(PbBPs)，PbBPs的形成與鉛在腎臟引起的一種特征性

3、病理改變-腎小管上皮細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)形成包涵體有關(guān)。研究提示，鉛穿過細胞膜，在細胞內(nèi)沉積、遷移以及發(fā)揮其毒作用，是以鉛結(jié)合蛋白結(jié)合的形式來進行的。所謂鉛結(jié)合蛋白是指與鉛有高親和結(jié)合能力，與細胞對鉛的適應性、反應性相關(guān)的細胞內(nèi)鉛受體和靶點蛋白質(zhì)。鉛刺激HK-2細胞出現(xiàn)凋亡、轉(zhuǎn)分化時，是否有PbBPs參與其中？起了什么作用？在腎小管上皮細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化細胞模型上分離鑒定PbBPs，將可能弄清楚鉛致細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化的真正原因所在，明了細胞內(nèi)的

4、分子靶點。并有可能找到新的高親和性的PbBPs，為開發(fā)鉛蛋白質(zhì)絡合劑藥物提供證據(jù)。本課題以出現(xiàn)明顯凋亡、轉(zhuǎn)分化的HK-2細胞為研究對象，采用鉛親和柱一金屬螯合親和層析、一維SDS-PAGE電泳分離、ESI-MS/MS液-質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定混合蛋白質(zhì)樣品，免疫印跡法驗證，這種功能蛋白質(zhì)組學方法篩選與HK-2細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化相關(guān)的鉛結(jié)合蛋白，用生物信息學方法分析鉛結(jié)合蛋白在鉛致HK-2細胞毒效應中的可能作用。 本研究首次在體外觀察到

5、醋酸鉛具有刺激人腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化作用；發(fā)現(xiàn)6個與鉛高親和性結(jié)合蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析顯示6個鉛結(jié)合蛋白與鉛致HK-2細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化有關(guān)；建立了一條新的高通量分離鑒定鉛結(jié)合蛋白的技術(shù)路線。 本課題共分三章進行研究： 第一章不同劑量醋酸鉛致人腎小管上皮細胞凋亡及碘化鉀的拮抗作用 目的：研究醋酸鉛對人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)細胞毒性、細胞凋亡劑量-反應關(guān)系及碘化鉀的拮抗作用；醋酸鉛對NF-kB、bc

6、l-2蛋白質(zhì)表達的影響及與細胞凋亡的關(guān)系。 方法：體外培養(yǎng)HK-2細胞分為不同劑量染鉛組：分別加入濃度為0、2.5、5、10、20、40μmol/L的醋酸鉛；碘化鉀干預組：加入終濃度為40mg/L的KI、37℃孵育30分鐘后加入上述不同劑量的醋酸鉛。染毒72h后分別用噻唑藍(MTT)法測定各組細胞的存活率；用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)改變；Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡以及Hoechst33258染色法、熒光顯微鏡觀察細

7、胞凋亡形態(tài)；用間接免疫熒光-流式細胞術(shù)檢測NF-KB、bcl-2蛋白表達改變。 結(jié)果：(1)使HK-2細胞存活率明顯下降的醋酸鉛最低濃度是10μmol/L，醋酸鉛濃度越高.細胞存活率越低，存在劑量.反應關(guān)系(r=-0.878，p<0.01)。(2)醋酸鉛作用72h，HK-2細胞LC50為15.68μmol/L;(3)從5μmol/L鉛劑量組開始細胞形態(tài)有明顯改變，HK-2細胞由正常的立方形、多角形向長梭形細胞轉(zhuǎn)變，高濃度鉛組有大

8、量細胞變小、變園，直至細胞脫壁漂?。?4)2.5μmol/L醋酸鉛即可引起HK-2細胞凋亡率明顯增加(p<0.05)，細胞凋亡率在10μmol/L鉛濃度達到高峰值，鉛濃度再增加，細胞凋亡率不再相應增加。(5) Hoechst33258染色，5μmol/L鉛組細胞核染色加深呈高亮藍色、模糊、核明顯固縮。10μmol/L鉛組大量細胞核濃染、固縮、核碎裂。(6)HK-2細胞NF-KB、bcl-2蛋白表達強度有隨著染鉛劑量增加而降低的趨勢，NF

9、-kB與Bcl-2降低顯著相關(guān)(r=0.71，p<0.01)。(7)細胞凋亡率與NF-kB、Bcl-2蛋白表達呈明顯負相關(guān)(r=-0.625，p<0.01與r=-0.709，p<0.01)。(8)各劑量鉛組加40mg/L的KI，可使細胞存活率增加，LC50上升了3.33倍，細胞凋亡率下降，細胞形態(tài)改變明顯改善。 結(jié)論：(1)醋酸鉛對HK-2細胞的毒性存在明顯劑量反應關(guān)系，低劑量醋酸鉛(2.5μmol/L)即可引起細胞凋亡明顯增加

10、，細胞形態(tài)改變，高濃度(10μmol/L)出現(xiàn)細胞大量壞死；醋酸鉛對HK-2細胞的LCso為15.68μmol/L。(2)醋酸鉛能下調(diào)HK-2細胞NF-KB、Bcl-2基因的表達，這可能是其誘導HK-2細胞凋亡的途徑之一。(3)40mg/L的KI可部分拮抗鉛對人腎小管細胞HK-2的損傷作用。 第二章醋酸鉛與碘化鉀對人腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化以及致纖維化標志基因表達影響 目的：探討醋酸鉛是否可以誘導人腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化及

11、其可能機制以及碘化鉀的影響。 方法：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細胞系( HK-2)細胞分為不同劑量染鉛組：分別加入濃度為2.5、5、10μmol/L的醋酸鉛，以10.0μmol/L醋酸鉛組作為對照；碘化鉀干預組：加入終濃度為40mg/L的KI、37℃孵育30分鐘后加入上述不同劑量的醋酸鉛。染毒72h后應用相差顯微鏡、間接免疫熒光，流式細胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)觀察HK-2細胞形態(tài)、a-SMA和FN蛋白表達的改變，

12、以及對致纖維化因子TGF-β1、CTGF的影響。 結(jié)果：(1)對照組正常人腎小管上皮細胞為近似方形或卵圓形，呈鵝卵石樣排列，細胞間緊密銜接，融合成單層。5μmol/l鉛組可見部分細胞形狀變長、呈梭形，細胞間分離生長。10μmol/l鉛組，除如上5μmol/l鉛組改變以外，尚有部分細胞邊界欠清晰、少數(shù)細胞變小、變園。(2)間充質(zhì)細胞標記a-SMA陽性細胞百分率在5、10μmol/L鉛組分別為9.32％、6.98％，與對照組比較明顯

13、增加，差別有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。(3)細胞外基質(zhì)(ECM)標志蛋白FN隨著醋酸鉛劑量的增加而增加，在5、10μmol/L組較對照組升高8.3、8.4倍，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(4)與對照組比較，5、10μmol/L醋酸鉛組TGF-βlmRNA以及蛋白表達均較對照組明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(5)2.5、5、10μmol/L醋酸鉛組CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達均較對照組明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<

14、0.05或P0.01)。(5)相同劑量醋酸鉛組加40mg/L的KI孵育，能在一定程度上抑制上述改變。 結(jié)論：(1)醋酸鉛可誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化，其作用機制可能與TGF-β1、CTGF表達調(diào)高有關(guān)。(2)40mg/l碘化鉀可以部分抑制鉛誘導的腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化以及TGF-β1、CTGF表達。 第三章人腎小管上皮細胞HK-2鉛結(jié)合蛋白分離鑒定 目的：篩選染鉛人腎小管上皮細胞鉛結(jié)合蛋白；分析鉛結(jié)合蛋白在鉛誘導H

15、K-2細胞凋亡、轉(zhuǎn)分化過程中的可能作用；探索一條新的高通量分離鑒定鉛結(jié)合蛋白的技術(shù)路線。 方法：(1)人腎小管上皮細胞系(HK-2)細胞分為5μmol/L染鉛組、對照組，醋酸鉛作用72h收獲細胞。(2)用非變性裂解液裂解細胞獲得水溶性蛋白質(zhì)樣品，用3kDa超濾管脫鹽和去除EDTA。(3)制備鉛親和柱( Pb-NTA)。(4)用鉛親和柱.金屬螯合親和層析分離與鉛有高親和性的蛋白質(zhì)。(5)1D-SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)。(6)

16、蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解。(7)混合蛋白質(zhì)肽段經(jīng)ESI-Q-TOF鑒定，輸出pkl文件。(8)將儀器輸出的pkl文件輸入數(shù)據(jù)庫(NCBInr)，使用Mascot軟件中的串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索功能進行搜索。(9)對獲得鑒定的蛋白質(zhì)進行生物信息學分析。(10)對質(zhì)譜鑒定出來的其中2個蛋白質(zhì)HSP90、TRAP-1進行Westem-bloting分析驗證。 結(jié)論：(1)在凋亡、轉(zhuǎn)分化HK-2細胞模型中篩選出6個鉛結(jié)合蛋白；(2)鉛誘導HK-2細胞凋亡